范忠軍，胡序明，郁　川，秦愛建，王歡莉

(1.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.鹽城師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224002)

DF-1細(xì)胞二維電泳方法的建立

范忠軍1,2，胡序明1，郁川1，秦愛建1，王歡莉2

(1.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.鹽城師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224002)

摘要：為了建立和優(yōu)化DF-1細(xì)胞二維電泳方法，對(duì)5種細(xì)胞裂解液進(jìn)行了比較；同時(shí)，還對(duì)提取的蛋白在不同的等電聚焦條件、水化條件、蛋白上樣量、SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度條件下的二維電泳圖譜進(jìn)行分析比較，并用PDQuest軟件分析優(yōu)化選擇。建立了DF-1細(xì)胞的二維電泳方法，獲得分辨率和重復(fù)性均可滿足分析要求的DF-1細(xì)胞的二維電泳圖譜。

關(guān)鍵詞：DF-1細(xì)胞；二維電泳；裂解液；蛋白質(zhì)組學(xué)

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(U0831002);國家行業(yè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(200803019)

作者簡介：范忠軍(1978-),男,江蘇鹽城人,講師,博士,主要從事動(dòng)物疫病方面的研究.

收稿日期：2014-07-01

文章編號(hào)：1672-6871(2015)02-0083-05

中圖分類號(hào)：S858.31;Q51

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：志碼：A

0引言

二維電泳是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)之一，是目前唯一能夠在一塊膠上連續(xù)分離數(shù)千種蛋白質(zhì)的方法，被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域[1-3]。在禽病毒病研究領(lǐng)域，由于二維電泳的應(yīng)用，人們對(duì)新城疫病毒、馬立克病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒等的感染機(jī)制都有了新的認(rèn)識(shí)[4-6]。

DF-1細(xì)胞來源于10日齡EV-0雞胚的成纖維細(xì)胞，是自發(fā)永生化的細(xì)胞。由于新城疫病毒、馬立克病毒、禽白血病病毒等禽類病毒均可以在該細(xì)胞上復(fù)制擴(kuò)增，所以，建立DF-1細(xì)胞的二維電泳方法為后期研究病毒感染細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

然而，二維電泳從一維等電聚焦到二維凝膠電泳整個(gè)試驗(yàn)過程比較長，中間每環(huán)節(jié)都會(huì)影響圖譜上蛋白點(diǎn)的分布，并最終影響質(zhì)譜分析的可靠性和準(zhǔn)確性。能夠得到蛋白分離率高、重復(fù)性好的二維電泳圖譜并不容易。本研究以DF-1細(xì)胞為研究對(duì)象，從樣品制備、聚焦時(shí)間、水化條件、上樣量和二維凝膠濃度等方面進(jìn)行優(yōu)化，最終建立了蛋白點(diǎn)展現(xiàn)較為理想的DF-1細(xì)胞二維電泳方法。

1材料與方法

1.1　主要試劑

三正丁基膦(TBP)購自Bio-Rad公司；3-[(3-膽酰胺丙基)-，二乙胺]-1-丙磺酸(CHAPS)購自AMRESCO公司；DNaseⅠ購自Sigma公司。

1.2　主要儀器

PROTEAN IEF Cell等電聚焦儀、PROTEANII Xi垂直電泳槽和PDQuest 8.0.1圖像分析軟件均購自Bio-Rad公司。

1.3　細(xì)胞總蛋白的提取

用橡膠刮刮下處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗2遍，4 ℃、500g離心5 min。收集的細(xì)胞按1×107個(gè)細(xì)胞加入500 μL裂解液中(見表1)，冰浴作用30 min，期間震蕩2~3次。冰浴下超聲波裂解，使用電流30 A，超聲3 min，間隔10 s。超聲結(jié)束后16 ℃、12 000g離心60 min。轉(zhuǎn)移上清液分裝，Bradford方法對(duì)樣品蛋白濃度進(jìn)行定量，放入-70 ℃冰箱保存。

1.4　二維電泳程序

等電聚焦使用pH 3-10NL的17 cm IPG膠條，取300 μg蛋白樣品溶解于水化液中，終體積為330 μL。等電聚焦程序(20 ℃)：50 V主動(dòng)水化14 h；250 V，慢速，2 h；500 V，慢速，1 h；1 kV，線性，1 h；8 kV，線性，3 h；8 kV，快速，45 kVh；500 V任意時(shí)間。取出膠條分別在平衡液Ⅰ和平衡液Ⅱ作用15 min。垂直向SDS-PAGE使用12%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的凝膠。先以每塊膠10 mA、45 min，然后每塊膠24 mA，電泳5 h。參照Candiano介紹的膠體考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行染色[7]。最后用去離子水脫色，直至背景清楚。

表1　裂解液的配方選擇

注：CHAPS為3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，4%CHAPS為質(zhì)量體積比；0.2% Bio-Lyte 3-10為體積比。

1.5　二維電泳程序優(yōu)化

等電聚焦過程中在8 kV電壓下聚焦對(duì)電壓和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，分別進(jìn)行80 kVh、60 kVh、45 kVh；將膠條浸入樣品液中，放在室溫中直接進(jìn)行溶脹14 h(被動(dòng)水化)，與在50 V電壓下的主動(dòng)水化進(jìn)行比較；對(duì)樣品進(jìn)行300 μg上樣量和600 μg上樣量的比較；對(duì)二維SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進(jìn)行凝膠10%和12%濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的比較。在程序優(yōu)化過程中其他程序不變，按1.4進(jìn)行。

1.6　圖像掃描與圖譜軟件分析

對(duì)脫色完全的凝膠用PowerLook 2100XL掃描儀掃描，光學(xué)分辨率設(shè)置為600 dpi進(jìn)行透射掃描，數(shù)字化圖像文件運(yùn)用PDQuest 2D Analysis(Version 8.0.1)軟件進(jìn)行一系列操作分析。圖像經(jīng)過調(diào)整、消除背景等處理后生成報(bào)告。

2結(jié)果

2.1　裂解液的選擇

從電泳結(jié)果來看(見圖1)，裂解液3(見圖1c)處理的樣品由于等電聚焦過程中電流過大，將膠條擊穿，無法進(jìn)行分析?？赡苁窃诹呀庖褐刑砑尤u甲基氨基甲烷(Tris)導(dǎo)致鹽濃度過高，造成等電聚焦的電壓出現(xiàn)問題。裂解液2(見圖1b)明顯在酸性端蛋白分離效果不好(圖1b左側(cè)為酸性端，右側(cè)為堿性端)。裂解液1、4、5的結(jié)果經(jīng)分析檢測的蛋白點(diǎn)數(shù)量均在1 000個(gè)左右。由圖1可看出：添加DNA酶Ⅰ(見圖1d)并沒有改善酸性端縱向拖尾現(xiàn)象，而添加磷酸三丁酯(TBP)(見圖1e)也沒有能緩解堿性端的縱向拖尾現(xiàn)象。也就說明添加DNA酶Ⅰ和TBP并不能顯著提高凝膠的分辨率。故本文選擇裂解液1(見圖1a)作為DF-1細(xì)胞的裂解液。

2.2　等電聚焦電壓和時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果

最初等電聚焦時(shí)所用的電壓和時(shí)間比較高，經(jīng)常造成橫向拖尾的現(xiàn)象。通過優(yōu)化等電聚焦電壓和時(shí)間的二維電泳圖見圖2。由圖2可看出：45 kVh無論在大分子量蛋白區(qū)還是在堿性端蛋白區(qū)的橫條紋都較少(見圖2c)。而采用80 kVh和60 kVh的電泳圖橫條紋過多(見圖2a和圖2b)，屬于典型的聚焦過度。

2.3　主動(dòng)水化和被動(dòng)水化選擇

樣品主動(dòng)水化和被動(dòng)水化的二維電泳圖見圖3。主動(dòng)水化會(huì)促進(jìn)大分子蛋白進(jìn)入膠條，而被動(dòng)水化有利于小分子量蛋白進(jìn)入膠條。主動(dòng)水化在酸性端分離比較好(見圖3a)，又因?yàn)橹鲃?dòng)水化條件容易控制，故本方法選用主動(dòng)水化來吸收樣品。

圖1　不同裂解液的二維電泳圖

圖2　優(yōu)化等電聚焦電壓和時(shí)間的二維電泳圖

圖3　樣品主動(dòng)水化和被動(dòng)水化的二維電泳圖

2.4　蛋白上樣量的選擇

圖4為樣品上樣量300 μg與600 μg的二維電泳圖。由圖4可見：600 μg的上樣量在整個(gè)酸性端都展現(xiàn)不理想，而且中性蛋白展現(xiàn)也不好(見圖4b)。300 μg上樣量在總體上蛋白都能得到很好地分離(見圖4a)。

圖4　樣品不同上樣量的二維電泳圖

2.5　二維凝膠濃度的選擇

圖5為SDS-PAGE 10%凝膠濃度和12%凝膠濃度的二維電泳圖。凝膠濃度大有利于小分子蛋白的分離。由圖5可知：10%和12%凝膠濃度的二維電泳圖的蛋白分離效果相似，10%凝膠濃度的蛋白聚集區(qū)要偏下一點(diǎn)，但有一些小分子蛋白檢測不到(見圖5a)。故本文最終選擇12%的凝膠濃度來分離蛋白。

圖5　SDS-PAGE不同凝膠濃度的二維電泳圖

圖6　 DF-1細(xì)胞的二維電泳優(yōu)化圖譜 (橫向?yàn)榈鞍装吹入婞c(diǎn)分布，縱向?yàn)?蛋白按分子量分布)

2.6　優(yōu)化結(jié)果

通過以上對(duì)DF-1細(xì)胞的二維電泳條件的優(yōu)化選擇，最終確定以裂解液1(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4% CHAPS，40 mmol/L DTT，0.2% Bio-Lyte3/10，1 mmol/L的蛋白酶抑制劑，痕量溴酚藍(lán))處理細(xì)胞。蛋白上樣量為300 μg，等電聚焦程序中以50 V進(jìn)行主動(dòng)水化14 h，等電聚焦采取45 000 Vh，最后以12%的凝膠來展現(xiàn)蛋白。圖6為優(yōu)化條件后的DF-1細(xì)胞的二維電泳圖譜。

3討論

電泳的本質(zhì)就是對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。二維電泳中樣品處理是為了將蛋白樣品天然的形式轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合等電聚焦電泳(IEF)的物理化學(xué)狀態(tài)，同時(shí)保持其原有組成的電荷和分子量。這就意味著樣品中的蛋白質(zhì)應(yīng)該是可溶的、非聚集的、變性的并處于還原狀態(tài)的。細(xì)胞樣品來源相對(duì)單一，獲取比較容易。對(duì)于細(xì)胞樣品來說，使蛋白處于合適的電泳狀態(tài)關(guān)鍵就是裂解液的選擇。

本試驗(yàn)中單獨(dú)使用9 mol/L尿素進(jìn)行裂解的電泳圖不如添加硫脲的，可能是因?yàn)榱螂逶黾恿怂嵝远说鞍椎娜芙?。但是在含有尿素和硫脲的裂解液有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)酸性端分離不好的現(xiàn)象，這一點(diǎn)可能又與硫脲的添加無關(guān)?？紤]到后期試驗(yàn)需要進(jìn)行病毒感染的差異比較，而病毒感染需要和一些膜蛋白受體結(jié)合，硫脲會(huì)增加疏水脂蛋白的溶解，而這是無法從軟件中分析的，只有質(zhì)譜才能驗(yàn)證，所以本文最終在裂解液中仍然選擇添加2 mol/L硫脲。

去污劑主要破壞氫鍵，使蛋白質(zhì)親水部分打開折疊，暴露離子團(tuán)。本文選擇目前二維電泳廣泛應(yīng)用的兩性離子去污劑CHAPS。Bio-Lyte兩性電解質(zhì)能夠有效阻止疏水蛋白之間的作用。

還原劑阻止在樣品裂解過程中氧化反應(yīng)的發(fā)生，破壞半胱氨酸殘基間的二硫鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)打開折疊，有利于單個(gè)組分的分析。一般使用DTT，由于本文的圖譜普遍存在堿性端拖尾現(xiàn)象，而這一現(xiàn)象的發(fā)生多數(shù)是因?yàn)镈TT本身會(huì)在IEF中隨著電流泳動(dòng)，造成堿性端DTT的損耗而使二硫鍵重新氧化[8]。所以，添加不隨電流泳動(dòng)的還原劑TBP，試圖改變這一狀況，但效果并不顯著。

在1975年，由O’Farrell提出的二維電泳技術(shù)，經(jīng)過近40年的發(fā)展已經(jīng)日趨成熟[9]。目前，該技術(shù)固有的缺陷主要是膜蛋白的溶解、低豐度蛋白展現(xiàn)[10]。雖然添加硫脲增加了膜蛋白的溶解，但研究并不能很好地解決這一問題[11-13]。本文試圖增加蛋白量來提高低豐度蛋白的展現(xiàn)，但結(jié)果卻影響了整個(gè)圖譜中蛋白的分離。二維電泳的上樣量可能存在一個(gè)飽和度的問題。之前很多文獻(xiàn)報(bào)道，二維電泳的重復(fù)性較差，其實(shí)二維電泳重復(fù)性差的問題在商品化、固定化膠條以及多膠凝膠系統(tǒng)的出現(xiàn)之后已經(jīng)解決了很多[9]，現(xiàn)今重復(fù)性的問題已經(jīng)不是電泳本身的問題，而是操作熟練程度和操作步驟過多造成的不可控。在DF-1細(xì)胞的二維電泳方法建立過程中，也可以充分證實(shí)這一結(jié)論。

在整個(gè)二維電泳過程中，本文并沒有對(duì)每個(gè)優(yōu)化條件進(jìn)行重復(fù)的摸索。因?yàn)橛绊懚S電泳結(jié)果的因素很多，如果操作得當(dāng)，每次結(jié)果均可以提供一些有用的信息。膠條的重復(fù)也有可能帶來另一些未知的問題，這是必然的。本文目的只是得到一種從肉眼上觀察蛋白分布理想、蛋白點(diǎn)清晰、雜條帶盡量少的圖譜。目前，隨著操作技術(shù)的熟練以及電泳方法的成熟，DF-1細(xì)胞的二維電泳圖已經(jīng)符合分析的要求。

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