韓承慧 馬海濤, 姜海濱① 劉 陽 韓慧宗 王 斐

(1. 上海海洋大學水產與生命學院 上海 201306; 2. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室煙臺 264006; 3. 中國科學院南海海洋研究所 廣州 510301)

許氏平 鲉 (Sebastes schlegeli), 又稱黑鲪, 屬鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉亞目(Scorpaenoidei)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉亞科(Sebastinae)、平鲉屬(Sebastodes)(成慶泰等, 1987), 廣泛分布于東海、黃海和渤海, 屬于卵胎生魚類(馮昭信, 2003), 具有肉質鮮美、營養(yǎng)豐富、生長速度快、抗逆性強等優(yōu)點, 是我國北方海區(qū)以及日本、韓國的重要養(yǎng)殖魚類之一(劉麗娟等, 2009)。目前養(yǎng)殖苗種以海捕野生苗為主要來源, 養(yǎng)殖成活率較低, 長期的過度捕撈也使許氏平鲉資源和遺傳多樣性遭到破壞, 因此, 進行其良種選育已成為保護我國許氏平鲉資源、促進其養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要手段(劉立明等, 2010)。

微衛(wèi)星 DNA標記, 又稱簡單序列重復(simple sequence repeats, SSR), 具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性高、信息含量大、共顯性等特點(徐莉等, 2002), 已經被廣泛應用于水產動物分子標記與數量性狀的相關系分析、遺傳結構分析、親緣關系鑒定、遺傳連鎖圖譜構建和QTL定位中(Zhan et al, 2005; 孫國華等, 2011;王文琪等, 2012; 初冠囡等, 2013)。

目前國內外對于許氏平 鲉 微衛(wèi)星標記的研究處于起步階段, 發(fā)表的微衛(wèi)星標記較少。日本學者Yoshida等(2005)首先利用兩重PCR擴增的方法獲得6個微衛(wèi)星標記; 韓國學者An等(2009)利用磁珠富集法獲得了14個微衛(wèi)星標記; Yasuike等(2013)利用454測序法篩選了 17個微衛(wèi)星標記。國內方面, Bai等(2011)運用磁珠富集的方法獲得了 18個微衛(wèi)星標記;初冠囡等(2013)發(fā)表了 17 個許氏平 鲉 微衛(wèi)星標記;賈超峰等(2014)報道了 15個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記。這些微衛(wèi)星標記遠遠不能滿足許氏平 鲉 群體遺傳結構分析、遺傳圖譜構建和分子標記輔助育種的需要。本研究首次運用高通量測序的方法從許氏平 鲉 基因組中開發(fā) 24個多態(tài)性較高的微衛(wèi)星標記, 并利用其對野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

許氏平鲉野生群體采自山東榮成附近海域, 養(yǎng)殖群體采自煙臺泰華海洋科技有限公司(國 家級黑鲪原種場)選育的長島群體選育子一代, 子一代個體為混合群體隨機取樣。榮成野生群體和煙臺養(yǎng)殖群體各取 36尾, 活體采集部分魚鰭樣品后浸泡于 70%乙醇中, 帶回實驗室–20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA的提取

采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取基因組 DNA(黃培堂, 2002)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的基因組DNA的完整性, NanoDrop2000分光光度計檢測DNA濃度和純度。使用時稀釋到50 ng/μL。

1.3 微衛(wèi)星引物的設計和篩選

選取完整性和純度高的單個個體DNA送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行基因組高通量測序, 并對含有微衛(wèi)星核心的序列設計引物, 選取200對微衛(wèi)星引物送由上海生工生物工程有限公司合成。首先選用三個不同個體DNA模板進行初步篩選,選出能穩(wěn)定擴增的微衛(wèi)星標記, 再通過溫度梯度PCR進行退火溫度的優(yōu)化。優(yōu)化后引物分別用FAM(熒光顏色為藍色)和HEX(熒光顏色為綠色)進行標記(表 1), 將篩選得到的微衛(wèi)星標記在野生群體中擴增, 對微衛(wèi)星標記進行評價, 然后在養(yǎng)殖群體中擴增, 對野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行評價。PCR反應體系為 25μL, 包括 2μL DNA模板(50ng/μL),2.5μL 10×buffer, 引物各1μL (50μmol/L), 0.5μL dNTP(10 mmol/L), 0.2μL Taq DNA 聚合酶(U/μL), 滅菌水補足。PCR反應程序為; 94℃預變性5min, 94℃變性40s, 退火反應40s, 72℃延伸1min, 30個循環(huán), 最后72℃延伸 10min。PCR產物經由 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 送至上海生工生物工程有限公司進行毛細管電泳。

1.4 數據的統(tǒng)計和處理

PopGene32軟件統(tǒng)計分析每一個位點的等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、香農-威納指數(I); GenePop軟件檢驗Hardy-Weinberg平衡, 并經Bonferroni校正; PIC Calc 6.0計算每個位點的多態(tài)信息含量(PIC)。

2 結果與分析

2.1 DNA提取結果

所提取的群體基因組 DN A溶解于 50μL的 T.E Buffer (pH=8.0)中, 濃度在 800—1000 ng/μL, 1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示條帶明顯, 無拖帶降解現象, 紫外分光光度計測定OD260nm/OD280nm在 1.8—1.9之間,說明樣品 DNA中蛋白質、RNA等殘存較少, 適合PCR擴增。

2.2 微衛(wèi)星標記的多態(tài)性分析

共篩選出 24個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記, 峰值多在5000—40000之間, 電泳條帶清晰, 說明這些微衛(wèi)星標記具有較高的可靠性, 能滿足群體遺傳多樣性分析的需要(圖1)。24對微衛(wèi)星標記在野生群體表現出了較高的多態(tài)性(表 2), 在野生群體中共檢測出204個等位基因, 每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(Na)在 2—21之間, 平均等位基因數為 8.5個, 其中位點HJ6-30、HJ6-32、HJ6-57和HJ7-46等位基因數最少,各得到 2個等位基因, 位點 HJ7-60的等位基因數最多, 得到 21個等位基因。有效等位基因數(Ne)為1.3340—15.3373, 平均值為 4.5484; 觀測雜合度(Ho)為0.0417—0.9167, 平均值為0.6059; 期望雜合度(He)范圍為 0.0278—0.9722, 平均值為 0.6041; 多態(tài)信息含量(PIC)在 0.1948—0.9496之間, 平均值為 0.6088,其中高度多態(tài)的位點(PIC＞0.5)有 14個, 占總位點數的 58.33%, 中度多態(tài)位點(0.25＜PIC＜0.5)有 6個, 占25%, 低度多態(tài)位點(PIC＜0.25)有4個, 占16.67%。

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢測

各個微衛(wèi)星位點的 Hardy-Weinberg平衡檢測結果表明(表 2), 在野生群體中 HJ6-18、HJ6-30、HJ6-31和HJ6-80顯著偏離了Hardy-Weinberg平衡,偏離位點數占總位點數的 16.67%, 在養(yǎng)殖群體中HJ6-19、HJ6-23、HJ7-60和HJ7-100顯著偏離平衡,占總位點數的 16.67%。其余位點均符合 Hardy-Weinberg平衡。

表1 24對許氏平鲉微衛(wèi)星引物特征Tab.1 Characteristics of 24 pairs of microsatellite primers for S. schlegeli

圖1 位點HJ7-44的部分毛細管電泳結果Fig.1 Samples of capillary electrophoresis results for locus HJ7-44

表2 24對微衛(wèi)星標記在野生群體和養(yǎng)殖群體中的遺傳多樣性參數Tab.2 Genetic diversity parameters of 24 microsatellite primers for wild and cultured populations of S. schlegeli

2.4 野生和養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

將篩選得到的24個微衛(wèi)星標記在養(yǎng)殖群體中擴增, 結果如下; 養(yǎng)殖群體的等位基因數(Na)為 2—14個, 平均值為 6.9583個; 有效等位基因數(Ne)為1.0571—9.2903, 平均值為 3.6365; 觀測雜合度(Ho)范圍為 0.0556—0.9722, 平均值為 0.6157; 期望雜合度(He)為 0.0548—0.9049, 平均值為 0.5840; 多態(tài)信息含量(PIC)為 0.0526—0.8825, 平均值為 0.5490; 野生群體和養(yǎng)殖群體的香農-威納多樣性指數為0.3768—2.8524、0.1269—2.3464, 平均值分別為1.4605和1.2834, 比較野生群體和養(yǎng)殖群體這六組數據的均值, 除觀測雜合度(Ho)外, 野生群體都高于養(yǎng)殖群體, 但對以上六組數據F檢驗無顯著差異。說明許氏平鲉野生群體的遺傳多樣性高于養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性, 但是兩者之間的差異并不顯著。

3 討論

微衛(wèi)星標記是分子遺傳研究中的一種重要手段,其獲得的方法有多種; 基因組文庫法、微衛(wèi)星富集法、數據庫查找法、近緣物種篩選法等(孫波等, 2009)。本研究首次使用高通量測序的方法從許氏平鲉基因組中開發(fā)微衛(wèi)星標記, 設計微衛(wèi)星引物200對, 結果得到了 190對可穩(wěn)定擴增的引物, 占 95%, 其中 24對微衛(wèi)星引物具有較高多態(tài)性, 證明這種方法可用于許氏平鲉基因組微衛(wèi)星標記的大規(guī)模開發(fā)。Weber(1990)認為只有在2堿基重復序列次數達到12次時微衛(wèi)星標記才能表現出較高的多態(tài)性。低度多態(tài)(PIC＜0.25)的位點有四個, 分別是 HJ6-32和 HJ6-57為兩堿基6重復, HJ7-38為三堿基 4重復和HJ7-46為三堿基5重復, 中度多態(tài)(0.25＜PIC＜0.5)的位點有4個, HJ6-30、HJ6-31、HJ7-66為兩堿基重復, 最多重復次數只有8次, HJ7-100為四堿基重復4次, 以上8個位點的核心序列重復均少于 12次, 相反核心序列重復次數多于12次的微衛(wèi)星標記均檢測出較高的雜合度和豐富的多態(tài)性, 這種現象在諸氏鯔蝦虎、三疣梭子蟹、中國明對蝦(蔡磊等, 2015)中也有報道, 因此在設計引物時應選用核心序列重復單元的重復次數在較高水平的序列, 從而避免篩選過程中得到較多低多態(tài)性的微衛(wèi)星標記。

24個微衛(wèi)星位點在野生群體中共檢測出 204個等位基因, 每個位點擴增出的等位基因數目2—21個不等, 明顯高于賈超峰等(2014)觀測到的 2—14個和初冠囡等(2013)觀測到的2—8個, 這可能與所選用的檢測方法有關, 以上兩者選用的為聚丙烯酰胺凝膠電泳, 此種方法分辨率較低, 微衛(wèi)星因其多態(tài)性較高,核心重復次數相差較少的兩條等位基因條帶可能相近, 導致條帶判讀產生誤差。本實驗選用的是毛細管電泳, 毛細管電泳技術因其高靈敏度、高分辨率、高速度、低耗樣等優(yōu)勢, 已經逐步代替了經典電泳技術(毛煜等, 2001), 得到的結果分辨率和準確性更高。

24個微衛(wèi)星標記在野生群體和養(yǎng)殖群體中各有四個位點顯著偏離了 Hardy-Weinberg平衡, 主要原因是純合子過剩。野生許氏平鲉營半定棲生活, 活動范圍較小, 這種生活習性有可能造成近親交配, 從而出現微衛(wèi)星位點偏離 Hardy-Weinberg平衡現象; 而養(yǎng)殖群體所用的親本數量一般比較少, 也可能造成近親交配并出現微衛(wèi)星位點偏離 Hardy-Weinberg平衡現象。另外, 無效等位基因的存在也能導致微衛(wèi)星位點偏離 Hardy-Weinberg平衡現象。研究表明在海洋經濟魚類、貝類、棘皮類的養(yǎng)殖群體中被檢測位點偏離Hardy-Weinberg平衡的現象普遍存在(耿慧君等,2009)。

最大限度地維持種內遺傳多樣性水平, 是持續(xù)利用種質資源的前提和基礎。群體的遺傳多樣性每喪失10%, 就會對其繁育能力、存活率、生長等重要性狀產生很大的負面影響(Allendorf et al, 1987)。多態(tài)信息含量(PIC)是指一個后代所獲的某個等位基因標記來自它親本的同一個等位標記的可能性大小(彭銀輝等, 2008), 野生群體和養(yǎng)殖群體的平均PIC值均大于0.5, 表明兩個群體均表現出較高的遺傳多樣性。野生群體的等位基因數、有效等位基因數、Shannon’s指數、期望雜合度和多態(tài)信息含量的平均值都高于養(yǎng)殖群體, 但對以上參數進行F檢驗后發(fā)現均無顯著差異(P＞0.05)。一方面, 本結果說明許氏平鲉養(yǎng)殖群體仍保持有較高的遺傳多樣性, 原因可能與養(yǎng)殖群體的親本數量較大和選育代數較少有關, 我們在進行許氏平鲉群體選育時, 一般會選擇較大數量的優(yōu)質個體作為親本, 從而有效地防止由于親本數量太少而造成選育子代遺傳多樣性降低的風險; 另外由于本研究所用養(yǎng)殖群體為群體選育子一代, 較少的選育代數減少了近親交配風險的發(fā)生, 從而也避免了選育子代遺傳多樣性降低的發(fā)生。另一方面, 單從數據上看野生群體的遺傳多樣性略高于養(yǎng)殖群體, 這說明人工定向選育對選育群體的遺傳多樣性也產生了一定的影響, 這提醒我們在下一步的良種選育中, 應進一步采取避免選育群體遺傳多樣性降低的措施,如定期補充野生個體作為親本等, 并利用微衛(wèi)星標記對其選育后代繼續(xù)進行遺傳監(jiān)控, 從而達到較好的選育效果。

本研究開發(fā)的24對許氏平鲉微衛(wèi)星標記為其遺傳連鎖圖譜構建和分子標記輔助育種提供了更多標記選擇, 對野生群體和養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性分析結果也為下一步的新品系選育提供了參考。

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