李玉龍 董 婧 王 彬 孫 明 王愛勇 王文波

(遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院 遼寧省海洋生物資源與生態(tài)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室 大連 116023)

近年來, 環(huán)境污染、溫室效應(yīng)及過度捕撈等因素使海洋生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生了有利于水母類的變化, 全球多處海域發(fā)生大型水母類的暴發(fā)現(xiàn)象, 大型水母暴發(fā)在破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡的同時對海洋漁業(yè)造成巨大負(fù)面影響, 已引起一系列的經(jīng)濟(jì)和社會問題(仲霞銘等, 2004; 程家驊等, 2004; Kawahara et al, 2006;Purcell, 2007; 孫松, 2012a, b)。據(jù)已有的文獻(xiàn)報道,我國近海也曾多次發(fā)生過大型災(zāi)害性水母暴發(fā)現(xiàn)象,其優(yōu)勢種主要為可食用但低值的沙蜇(Nemopilema nomurai)和無食用價值的海月水母(Aurelia spp.)和霞水母(Cyanea spp.) (董婧等, 2013)。

霞水母隸屬于刺胞動物門(Cnidaria)、缽水母綱(Scyphomedusae)、旗口水母目(Semaeostomeae)、霞水母科(Cyaneidae), 是一種廣布性的大型海洋浮游生物, 通常以小型浮游動物為餌, 在我國沿海均有分布,目前已發(fā)現(xiàn)有白色霞水母(Cyanea nozakii)、發(fā)形霞水母(Cyanea capillata)、棕色霞水母(Cyanea ferruginea)和紫色霞水母(Cyanea purpurea)四種(董婧等, 2013),其中以白色霞水母數(shù)量最多、分布范圍最廣。白色霞水母是在我國常見的曾多次暴發(fā)過的水母, 自 20世紀(jì)末起, 黃海、東海、南海近海多次發(fā)生霞水母暴發(fā)現(xiàn)象, 因其生長過程中分泌毒素并纏粘網(wǎng)具, 造成海洋漁業(yè)資源枯竭, 海洋捕撈產(chǎn)量嚴(yán)重下降(董婧等,2013), 如2004年遼東灣白色霞水母暴發(fā)導(dǎo)致的海蜇大面積減產(chǎn), 其主要原因是生物災(zāi)難——霞水母旺發(fā), 次要原因是海水污染(葛立軍等, 2004)。

針對白色霞水母等大型災(zāi)害水母暴發(fā)引起的一系列問題, 其早期生活史階段的有效鑒定與觀測對查清在自然海域中白色霞水母的生長發(fā)育和暴發(fā)性增殖具有重要意義。霞水母具有世代交替生活史(Donget al, 2006), 其浮浪幼蟲、螅狀體、碟狀體等個體微小(毫米以下)難于觀測, 制約了研究者對其早期生長階段數(shù)量變化及其分布擴(kuò)散等方面的研究。

分子生物技術(shù)的快速發(fā)展為解決上述難題提供了新契機(jī), 目前已有一些學(xué)者(Bayhaet al, 2009; Kiet al, 2010; 王建艷等, 2013)利用線粒體分子標(biāo)記如COI、16S等開發(fā)了白斑水母(Phyllorhizaspp.)、金黃水母(Chrysaorasp.)和海月水母(Aureliasp.)螅狀體和碟狀體的分子鑒定和檢測技術(shù); 張姝等(2009)和楊傲傲(2014)分別利用16S rRNA、COI基因片段和核基因β-連環(huán)蛋白對我國兩種常見大型水母海蜇和沙蜇進(jìn)行了分子甄別鑒定研究。但上述所研究的水母種類未包括白色霞水母, 所用的分子標(biāo)記主要為線粒體分子標(biāo)記, 利用核基因分子標(biāo)記如核糖體 DNA對大型水母進(jìn)行的研究較少, 目前僅劉敏等(2011)利用 18S rDNA對沙蜇和口冠水母(Stomolophus meleagris)的分類關(guān)系進(jìn)行了分析; Bayha等(2010)利用 18s和 28s rDNA序列分析了缽水母綱的系統(tǒng)和進(jìn)化關(guān)系。

rDNA(核糖體 DNA)為多拷貝基因, 在真核生物中可以達(dá)到1000個重復(fù)(Schl?tterer, 1998), 每個重復(fù)單元包括編碼區(qū)18S、5.8S 和28S rDNA以及非編碼區(qū) ITS1和 ITS2, 其在細(xì)胞中以一種協(xié)同方式進(jìn)化,重復(fù)序列間基本保持一致。rDNA具有高變異和高保守兩種區(qū)域, 在海洋動物的分類、種質(zhì)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育中得到廣泛應(yīng)用(Chuet al, 2001; Chenet al, 2002;Dawsonet al, 2005; Wannaet al, 2006; Kiet al, 2009;Bayhaet al, 2010)。2004年遼東灣暴發(fā)的霞水母經(jīng)形態(tài)鑒定為白色霞水母(董婧等, 2005), 其暴發(fā)使遼東灣海蜇數(shù)量銳減并造成生態(tài)災(zāi)難, 當(dāng)年遼東灣海域高溫高鹽的外部環(huán)境特征是誘使其暴發(fā)的重要原因(王彬等, 2014)。Dong等(2006, 2008)首次揭示了遼東灣白色霞水母的生活史并對各發(fā)育階段的形態(tài)進(jìn)行了描述, 但不同水母種類螅狀體及碟狀體階段形態(tài)相似不易區(qū)分且樣品易被破壞, 這都增加了傳統(tǒng)分類的難度。因此, 本研究利用rDNA分子標(biāo)記對白色霞水母各發(fā)育階段的的樣品進(jìn)行分析, 為建立白色霞水母早期階段螅狀體和碟狀體的物種鑒定和檢測方法提供參考, 同時為其它大型水母的鑒定和分類以及系統(tǒng)發(fā)生研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究所用白色霞水母包括螅狀體、碟狀體和水母體。其中螅狀體、碟狀體為2004年9月在遼東灣捕獲的白色霞水母親體進(jìn)行人工繁殖所得, 水母體為2009年采自遼東灣北部海域。根據(jù)董婧等(2013)列出的黃、渤海4種常見大型水母螅狀體、碟狀體的特征差別(表1、圖1), 對研究所用螅狀體、碟狀體樣品進(jìn)行了形態(tài)分類鑒定, 以確保樣本采集的準(zhǔn)確性。

1.2 DNA提取、擴(kuò)增及測序

采用CTAB法提取基因組DNA后, 分別利用引物 SSU-U: 5′-AAC CTG GTT GAT CCT GCCAGT- 3′;SSU-L: 5′-TGA TCC TTC TGC AGG TTC ACC TAC-3′和 JF-18F1750 5′-AAAGTCGTAACAAGGTTTCCG-3′; JF-28R765 5′-TTGGTCCGTGTTTCAAGACG-3′ (Kiet al, 2009)對白色霞水母1個螅狀體樣品、1個碟狀體樣品和 3個水母體樣品進(jìn)行擴(kuò)增, 反應(yīng)體系 25μL,包括: 0.2mmol/L每種 dNTPs, 0.2μmol/L每種引物,1μLDNA 模板, 1U Taq, 2.0mmol/L MgCl2, 2.5μL 10×緩沖液, 滅菌超純水補(bǔ)足剩余體系。PCR擴(kuò)增在Gene Amp9700型 PCR儀上進(jìn)行, 反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3min后, 95℃變性30s, 50℃退火30s, 72℃延伸45s,運(yùn)行35個循環(huán), 最后72℃下延伸5min。擴(kuò)增后進(jìn)行雙向測序[寶生物工程(大連)有限公司]。

表1 4種缽水母類螅狀體形態(tài)特征(董婧等, 2013)Tab.1 Morphological characteristics of four jellyfish polyps

1.3 數(shù)據(jù)分析

測定的18S和ITS-5.8S rDNA序列進(jìn)行BLAST(http://www. ncbi.nlm.gov/BLAST/)檢索, 確定序列為目的片段。應(yīng)用CLUSTAL X 1.8軟件(Thompsonet al,1997)對序列進(jìn)行比對及相似性分析。通過 MEGA 3.0(Kumaret al, 2004)統(tǒng)計堿基含量、變異位點(diǎn), 采用Kimura雙參數(shù)模型計算種間、屬間的遺傳距離。用MEGA3.0軟件構(gòu)建NJ(Neighbour-joining)系統(tǒng)樹, 采用Bootstrap1000檢驗分子系統(tǒng)樹各分支的置信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 18S和ITS-5.8S rDNA基因序列分析

按照 CTAB法提取不同生活史階段(螅狀體、碟狀體及水母體)的白色霞水母的 DNA, 所有個體都成功進(jìn)行 PCR擴(kuò)增, 經(jīng)測序分別得到長度 1728bp的18S rDNA基因片段和長度1531bp的18S-ITS-5.8S-28S rDNA基因序列。本研究中白色霞水母5個個體的18S rDNA基因序列共享一個基因型, 與GenBank中采自青島膠州灣的白色霞水母樣品(JX845355)同源序列完全一致。5個白色霞水母樣品ITS-5.8S rDNA序列完全一致, ITS1、5.8S rDNA和ITS2長度分別為270bp、158bp、249bp, 與GenBank中未知真核生物(表2)的序列高度相似(≥99%), 其序列來源物種的環(huán)境信息顯示這些序列都是從南海北部表層海水中獲得的未指明來源的物種, 推測其可能是白色霞水母生活史的早期階段(卵、浮浪幼蟲或碟狀體)。

結(jié)合GenBank中已有霞水母種類的18S rDNA、ITS1同源序列(表 2), 對霞水母屬不同種類的 18S rDNA和 ITS1片段進(jìn)行了序列分析。5種霞水母屬18S rDNA序列經(jīng)比對后同源序列長度為1709bp, 多態(tài)位點(diǎn)數(shù)33個, 約占總序列的 1.9%, 其中簡約信息位點(diǎn)數(shù)33個, 插入/缺失位點(diǎn)6個。由于GenBank數(shù)據(jù)庫中其它霞水母種類只含核糖體 ITS1片段, 因此僅對ITS1序列進(jìn)行了分析。去掉兩側(cè)18S rRNA與5.8S rRNA基因序列, ITS1長度為264—379bp, 具有明顯的種間序列長度多態(tài)性, 變異幅度較大。比對后保留同源序列, 長度為 368bp, 其中多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為203個, 約占總序列的55%, 簡約信息位點(diǎn)數(shù)178個,單變異位點(diǎn)21個。除種間長度多態(tài)性外大部分種類還具有種內(nèi)序列長度多態(tài)性, 這種種內(nèi)序列長度多態(tài)性產(chǎn)生的原因基本上是由于微衛(wèi)星序列插入/缺失所致。

表2 霞水母屬18S和ITS-5.8S rDNA序列信息Tab.2 Information of 18S and ITS-5.8S rDNA gene in Cyanea jellyfish species

2.2 霞水母屬種內(nèi)和種間遺傳距離

表2—表3列出了基于18S rDNA和ITS1基因序列的霞水母屬種內(nèi)和種間的遺傳距離。由表3可以看出基于18S rDNA計算的種間遺傳距離最小值出現(xiàn)在霞水母Cyaneasp.和安娜霞水母、玫瑰紅霞水母之間(0.001), 最大值出現(xiàn)在白色霞水母和藍(lán)水母之間(0.019), 其中白色霞水母與其它幾種霞水母的差異較大(0.017—0.019)。平均的種間遺傳為0.008, 種內(nèi)遺傳距離為0。基于ITS1計算的霞水母種間及種內(nèi)的K2P遺傳距離見表4, 與18S rDNA計算的遺傳距離的結(jié)果一致, 白色霞水母與其它幾種霞水母的差異較大(0.325—0.543), 其中白色霞水母遼東灣樣品與南海未指明來源的物種的序列高度一致, 因此將其視為中國白色霞水母樣品, 其與日本白色霞水母樣品間的遺傳距離為 0.424, 這個值甚至大于霞水母不同種間的遺傳距離值。白色霞水母日本樣品和玫瑰紅霞水母之間(0.543)遺傳距離最大, 安娜霞水母和發(fā)形霞水母之間(0.104)的遺傳距離最小, 平均的種間遺傳為 0.284, 種內(nèi)的K2P遺傳距離范圍為0.002—0.056, 平均K2P遺傳距離為0.019?；贗TS1的種種間遺傳距離是種內(nèi)遺傳距離的15倍, 適合于進(jìn)行物種鑒定。

表3 基于18S rDNA的霞水母屬種內(nèi)和種間遺傳距離Tab.3 Intraspecific and interspecies genetic distance amongCyanea jellyfish species based on the 18S rDNA

表4 基于ITS1序列的霞水母屬種內(nèi)和種間遺傳距離Tab.4 Intraspecific and interspecies genetic distance among Cyanea jellyfish species based on the ITS sequences

2.3 系統(tǒng)分析

基于18S rDNA和ITS1片段構(gòu)建的霞水母NJ系統(tǒng)樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖2所示, 結(jié)果顯示, 不同的方法構(gòu)建的系統(tǒng)樹差異不大, 同種的不同個體, 親緣關(guān)系較近的不同種各自聚支, 其聚類結(jié)果大致與形態(tài)分類吻合, 但基于 ITS1構(gòu)建的系統(tǒng)樹的聚枝結(jié)果比基于18S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)樹得到更高的自舉檢驗的支持, 說明 ITS1具有豐富的系統(tǒng)發(fā)育信息位點(diǎn), 更適于大型水母種、屬水平的系統(tǒng)分析研究。

3 討論

3.1 白色霞水母的鑒定及自然海域中其早期階段的新發(fā)現(xiàn)

白色霞水母與其它缽水母類相似都具有世代交替的生活史, 受精卵經(jīng)浮浪幼蟲、螅狀體、碟狀體發(fā)育為成體水母(Donget al, 2006, 2008), 除螅狀體外,其它都營浮游性生活。通常情況下多種缽水母生活于同一水域, 其螅狀體、碟狀體形態(tài)較為相似, 難以用肉眼區(qū)分不同的種類, 給水母初期調(diào)查工作種類區(qū)分帶來很大困難。如海蜇、沙蜇、海月水母和白色霞水母是黃、渤海水域常見的四種大型水母, 它們的螅狀體形態(tài)大致相同, 其相同和相異的特征如表1所示,且螅狀體的外觀形態(tài)與其存活生長狀態(tài)息息相關(guān),從形態(tài)上很難區(qū)分(董婧等, 2013)。關(guān)于四種大型水母的碟狀體, 一般通過碟狀體緣瓣形狀、感覺裂縫占緣瓣長度比例和刺細(xì)胞團(tuán)的分布位置加以區(qū)分, 沙蜇、海蜇碟狀體具有爪狀的緣瓣, 白色霞水母和海月水母碟狀體的緣瓣鈍圓。白色霞水母碟狀體的感覺裂縫較深, 占緣瓣長度比例大于 1/2, 其它種類碟狀體感覺裂縫較淺(圖 1)。因此, 缽水母螅狀體、碟狀體的形態(tài)分類十分繁瑣和困難, 必須由有經(jīng)驗的專業(yè)人員借助顯微鏡觀察才能進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。

單獨(dú)挑取1個白色霞水母螅狀體、碟狀體及水母體進(jìn)行 DNA提取及檢測, 所有樣品都成功擴(kuò)增出目的片段, 結(jié)果表明從核酸提取到PCR擴(kuò)增、測序并進(jìn)行系統(tǒng)分析的分子生物學(xué)技術(shù)手段具有很高的靈敏度, 只要樣品中含1個螅狀體或碟狀體即可檢出。本研究利用18S rDNA和ITS-5.8S基因片段分析了白色霞水母螅狀體、碟狀體和水母體樣品, 從分子水平上佐證了采自遼東灣的霞水母樣品為白色霞水母(董婧等, 2005), 這也說明分子生物學(xué)方法具有很高的準(zhǔn)確性。同時, 通過序列比對發(fā)現(xiàn)GenBank數(shù)據(jù)庫中從南海北部表層海水中獲得的未指明來源的物種的 ITS-5.8S序列與遼東灣白色霞水母樣品的同源序列高度相似(≥99%), 據(jù)此推測該物種可能為自然海域中早期發(fā)育階段(卵、浮浪幼蟲或碟狀體)的白色霞水母, 這與盧振彬等(2003)報道的關(guān)于霞水母(主要為白色霞水母)是福建沿海(南海北部)水母類優(yōu)勢種的分布相符。研究結(jié)果表明 ITS-5.8S基因序列可能是解決白色霞水母不同階段分類鑒定與檢測的有效分子標(biāo)記。

圖2 基于18S rDNA(a)和ITS1(b)基因片段構(gòu)建的霞水母屬NJ系統(tǒng)樹Fig.2 Molecular phylogenetic tree of Cyanea jellyfish species based on the fragments of 18S rDNA (a) and ITS1 (b) (NJ method)分支節(jié)點(diǎn)附近的數(shù)字為bootstrap值

3.2 不同海區(qū)霞水母的遺傳分化

本研究中, 基于18S rDNA和ITS-5.8S基因片段計算的霞水母屬種間遺傳距離(表3、表4)表明分布距離越遠(yuǎn)的霞水母種間遺傳差異越明顯, 如分布于中國及日本附近海域的白色霞水母與其它幾種霞水母(主要分布于澳大利亞、美國附近海域)的遺傳距離明顯高于相距較近的霞水母間的種間遺傳距離, 漫長的進(jìn)化歷史和長期的隔離分化是導(dǎo)致形成這種現(xiàn)象的主要原因。此外, 中國海域白色霞水母樣品與日本附近海域白色霞水母樣品的遺傳距離為 0.424, 而來自中國的樣品間序列差異為0—0.008, 日本的樣品間序列差異 0.03—0.079, 兩個地方的樣品間差異極大甚至大于霞水母屬不同種間的遺傳距離, 說明白色霞水母中國樣品與日本樣品間有明顯的遺傳分化;這種現(xiàn)象在馬賽克水母及海月水母中都存在, 其原因是長期隔離分化所致(Dawson et al, 2005)。另一種可能是樣品鑒定錯誤導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差, 這個問題的解決還需要分析更多的樣品和更多的DNA片段加以確定。

3.3 核糖體 rDNA基因在大型水母類物種鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析中的應(yīng)用

很多學(xué)者(Bucklin et al, 2003)包括國際海洋生物普查組織都認(rèn)為 18S rDNA 序列是適用于進(jìn)化較慢物種的種類鑒定和系統(tǒng)分析的合適分子標(biāo)記, 但由于其基因序列較為保守, 在解決較小分類階元如屬的種間關(guān)系尤其是在進(jìn)行某些近緣種的物種鑒定時具有較大的局限性, 其可能更適合進(jìn)行較高階元的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系研究(Hwang et al, 1999)。與之相反, 核糖體ITS片段處于非編碼區(qū), 受選擇壓力較小、進(jìn)化較快, 具有豐富的變異位點(diǎn)信息, 適合作為物種鑒定及種、群體水平的分子標(biāo)記。Chu等(2001)在利用ITS1序列對 7種甲殼類動物進(jìn)行分析時發(fā)現(xiàn)不同甲殼動物的 ITS1序列差異明顯, 可作為種間和群體水平的分子標(biāo)記。本研究利用18S和ITS-5.8S rDNA基因序列對霞水母屬不同種類進(jìn)行的分析表明, 序列變異方面所分析的霞水母不同種類間ITS1基因片段明顯比18S rDNA片段變異更大, 其種間遺傳距離平均值是種內(nèi)遺傳距離平均值的 15倍, 更符合作為物種鑒定的DNA條形碼(Hebert et al, 2003a, b); 在系統(tǒng)進(jìn)化方面, 兩種片段構(gòu)建的 NJ系統(tǒng)發(fā)育樹都顯示同種的不同個體, 親緣關(guān)系較近的不同種各自聚枝, 但 18S rDNA基因進(jìn)化速率較慢, 在解決部分近緣種的進(jìn)化關(guān)系時有較大的局限, 可能更適于大型水母科間和科內(nèi)屬間的進(jìn)化關(guān)系研究。因此, 在進(jìn)行大型水母類分子系統(tǒng)進(jìn)化研究時應(yīng)聯(lián)合采用多個進(jìn)化速率不同的分子標(biāo)記以得出更為全面準(zhǔn)確的結(jié)論。

4 結(jié)論

(1) 利用18S rDNA和ITS-5.8S基因片段對白色霞水母螅狀體、碟狀體和成體水母樣品進(jìn)行的分析表明采自遼東灣的霞水母樣品為白色霞水母, 白色霞水母樣品的ITS-5.8S rDNA序列與GenBank中未知真核生物的序列高度相似(≥99%), 推測該物種可能為自然海域中早期發(fā)育階段(卵、浮浪幼蟲或碟狀體)的白色霞水母。

(2) 分布距離越遠(yuǎn)的霞水母種間遺傳差異越明顯, 中國海域白色霞水母樣品與日本附近海域白色霞水母樣品的遺傳差異極大甚至大于霞水母屬不同種間的遺傳距離, 霞水母漫長的進(jìn)化歷史和長期的隔離分化是導(dǎo)致形成這種遺傳分化的主要原因。

(3) 霞水母不同種類間ITS1基因片段明顯比18S rDNA片段變異更大, 具有更豐富的變異位點(diǎn)信息,適合作為大型水母物種鑒定及種、群體水平的分子標(biāo)記; 18S rDNA基因進(jìn)化速率較慢, 在解決部分近緣種的進(jìn)化關(guān)系時有較大的局限, 更適合進(jìn)行大型水母科間和科內(nèi)屬間的進(jìn)化關(guān)系研究。

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