丁西朋+羅小燕+張龍+王文強+白昌軍

摘 要 為鑒定糙柱花草種質(zhì)的遺傳背景和親緣關(guān)系，提高其利用效率，利用來自不同柱花草種中的16個SSR標(biāo)記對14份糙柱花草種質(zhì)進行遺傳多樣性和聚類分析。結(jié)果表明：在16個SSR標(biāo)記中，10個SSR標(biāo)記在14份糙柱花草種質(zhì)間具有多態(tài)性。10個多態(tài)性SSR標(biāo)記共檢測到32個等位基因，每個標(biāo)記可檢測到2～8個等位基因，平均為3.20個；每個SSR標(biāo)記的Shannon信息指數(shù)（I）和多態(tài)性信息含量（PIC）分別為0.191～0.796和0.173～0.769，平均為0.474和0.411。14份糙柱花草種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)為0.438～0.938，平均為0.733。聚類分析結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.74處，14份供試糙柱花草種質(zhì)可明顯被分為3類，其中III類中的CPI 93116柱花草與其他種質(zhì)遺傳關(guān)系較遠。

關(guān)鍵詞 糙柱花草 ；種質(zhì)資源 ；SSR標(biāo)記 ；遺傳多樣性

分類號 S54

Stylosanthes scabra Genetic Diversity Analysis by SSR Markers

DING Xipeng LUO Xiaoyan ZHANG Long WANG Wenqiang BAI Changjun

（Institute of Tropical Crops Genetic Resources， CATAS， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract To identify the genetic background and relationship of Stylosanthes scabra varieties and promote the further utilization of them， the genetic diversity of 14 S. scabra varieties was analyzed using 16 SSR markers developed from other different Stylosanthes species. Result： Among 16 SSR markers， 10 markers were polymorphic among 14 S. scabra materials. A total of 32 alleles were generated by the 10 polymorphic markers， and the number of alleles of SSR markers ranged from 2 to 8 with an average of 3.20 alleles. The Shannon's information index and polymorphic information content each polymorphic SSR marker varied from 0.191 to 0.796 and 0.173 to 0.769， with an average of 0.474 and 0.411， respectively. The genetic similarity coefficients of 14 S. scabra materials were from 0.438 to 0.938 with an average of 0.733. The cluster analysis showed that the 14 S. scabra materials could be obviously divided into 3 clusters at genetic similarity coefficient of 0.74. The lower genetic relation was presented between S. scabra CPI 93116 in cluster III and other S. scabra materials.

Keywords Stylosanthes scabra ；germplasm ； SSR marker ； genetic diversity

糙柱花草具有很強的抗旱性，是熱帶地區(qū)放牧草地應(yīng)用最廣泛的柱花草種[1]。西卡柱花草（Styosanthes scabra‘Seca）是由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所引進選育而成的優(yōu)良糙柱花草品種，是華南干旱、半干旱地區(qū)人工草地建設(shè)和天然草地改良的首選草種，在海南、云南、廣東、廣西、四川、貴州、福建等省區(qū)累計推廣面積超過1萬hm2[2-3]。糙柱花草為異源四倍體，其二倍體祖先為粘質(zhì)柱花草（Styosanthes viscosa）和灌木柱花草（S. seabrana）[4]。糙柱花草為典型的自花授粉植物，異交率僅為1%～2%[5]。目前為止，對糙柱花草種質(zhì)資源遺傳多樣性研究的報道非常少。Maass[6]通過對糙柱花草的形態(tài)指標(biāo)及農(nóng)藝性狀經(jīng)常考察及聚類分析，最終將糙柱花草資源分為4類；Liu[1]利用21對RAPD標(biāo)記將93份糙柱花草資源分為5類。SSR標(biāo)記作為一種重要的分子標(biāo)記技術(shù)，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、操作簡單等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛于遺傳學(xué)研究的諸多領(lǐng)域[7]。在柱花草中已報道的可用SSR標(biāo)記共139個，其中44個來自圭亞那柱花草、26個來自大頭柱花草（S. macrocephala）、23個來自灌木柱花草、23個來自頭狀柱花草（S. capitata），其他的來自其他14個不同的柱花草種[8-14]，這些SSR標(biāo)記主要應(yīng)用于柱花草種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和核心種質(zhì)的構(gòu)建。Chandra等[8]利用開發(fā)的41個SSR標(biāo)記對灌木柱花草的20份種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析。Santos-Garcia等[15]利用20個SSR標(biāo)記對圭亞那柱花草資源進行了遺傳多樣性及聚類分析，將150圭亞那柱花草分為9 類。Santos-Garcia等[16]利用SSR標(biāo)記對134份大頭柱花草種質(zhì)和192份頭狀柱花草種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，構(gòu)建了分別含有23份大頭柱花草和13份頭狀柱花草的核心種質(zhì)。但SSR標(biāo)記在糙柱花草種質(zhì)資源中的開發(fā)及應(yīng)用尚未見報道。本課題組對123個在其他柱花草種中開發(fā)的SSR標(biāo)記進行篩選，結(jié)果獲得了79個在糙柱花草中能有效擴增的SSR標(biāo)記[17]。在本研究中，利用其中16個在糙柱花草中能有效擴增、條帶清晰且多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記對14份糙柱花草種質(zhì)資源的遺傳背景及親緣關(guān)系進行鑒定，為糙柱花草資源的引進及利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用14份糙柱花草種質(zhì)包含3個栽培品種（西卡柱花草、費特羅雷柱花草和斯倫柱花草）和其他11份資源（表1），其中3份糙柱花草種質(zhì)為中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院（CATAS）熱帶作物品種資源研究所收集，6份引自澳大利亞國際熱帶農(nóng)業(yè)研究中心（ACIAR），5份引自哥倫比亞國際熱帶農(nóng)業(yè)中心（CIAT）。14份糙柱花草種質(zhì)資源均種植在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心基地，按照日常大田管理辦法進行管理。

1.2 SSR擴增與分析

采集糙柱花草苗期的新鮮葉片置于液氮中，按本實驗室改良CTAB 法提取柱花草的基因組DNA[17]，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoVue超微量分光光度計（GE Healthcare）檢測DNA的質(zhì)量和濃度，將DNA稀釋至50 ng/μL后置于-20℃?zhèn)溆谩膹堼埖萚17]篩選獲得的在8個不同柱花草種中都能有效擴增且條帶清晰的SSR標(biāo)記中，挑選16個SSR標(biāo)記對14份糙柱花草種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析（表2），引物由上海生工生物工程公司合成。PCR擴增條件及程序根據(jù)丁西朋等[18]描述的方法進行，采用20 μL的PCR反應(yīng)體系：50 ng/μL模板DNA 1 μL，5 μmol/μL上下游混合引物0.8 μL，2.5 μmol/μL dNTPs 1.2 μL，10×PCR Buffer 2 μL，5 U/μL Taq聚合酶0.2 μL，最后用ddH2O補足。PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用8% PAGE（Polyacrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠電泳）電泳后，采用硝酸銀染色法進行顯影，最后拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以DL2000 DNA marker作為擴增產(chǎn)物片段大小的參考，對大小合適、清晰且易于辨認(rèn)的譜帶采用“0，1”系統(tǒng)記錄，無條帶記為“0”，有條帶記記為“1”。將記錄的原始數(shù)據(jù)匯總到Excel表格中生成數(shù)據(jù)矩陣，用于擴增條帶的多態(tài)性比較和聚類分析。利用NTSYS-pc 2.10e軟件分析糙柱花草種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)（Genetic similarity coefficient，GS），然后根據(jù)GS值采用非加權(quán)組平均法（Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means，UPGMA）對供試糙柱花草材料進行聚類分析[19]。利用POPGENE 1.32軟件計算每個位點的遺傳多樣性參數(shù)，包括等位基因數(shù)、等位基因頻率和Shannon信息指數(shù)（I）[20]。每個位點的多態(tài)性信息含量（Polymorphic Information Content，PIC）按如下公式進行計算：

PIC=1-（Pi2）-2Pi2Pj2

其中，n表示每個位點檢測到的等位基因數(shù)目，Pi、Pj表示第i、j個等位基因在供試材料中出現(xiàn)的頻率[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR擴增結(jié)果

本研究利用16個SSR標(biāo)記對14份糙柱花草種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析（圖1）。結(jié)果表明：選用的16個SSR標(biāo)記中，有10個SSR標(biāo)記在14份糙柱花草材料中具有多態(tài)性。由表3可知，這10個多態(tài)性SSR標(biāo)記共產(chǎn)生等位基因32個，每個標(biāo)記檢測到的等位基因數(shù)為2～8個，平均為3.20個。10個多態(tài)性SSR標(biāo)記的I值和PIC值的變化范圍分別為0.191～0.796和0.173～0.769，平均為0.474和0.411。I值和PIC值都以標(biāo)記SSR5最大，標(biāo)記SSR109最小，表明SSR5具有較高的多態(tài)性檢測效率。

2.2 遺傳多樣性分析結(jié)果

基于10個多態(tài)性SSR標(biāo)記的帶譜，利用NTSYS-pc 2.10e對14份糙柱花草種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，14份糙柱花草種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)GS為0.375～0.938，平均為0.733（表4）。其中CPI 33260與費特羅雷柱花草（0.938）、CIAT 1077與CIAT 1080（0.938）的遺傳相似性最大。而費特羅雷柱花草（0.375）、TPRC250（0.438）、CPI 33260（0.438）、Q10042（0.469）、CIAT 1077（0.469）和CIAT 1080（0.469）與CPI 93116的遺傳相似系數(shù)最低，均在0.500以下。從各糙柱花草種質(zhì)間平均相似系數(shù)來看，CPI 93116與其他材料的平均相似系數(shù)最低，為0.488，表明CPI 93116與其他種質(zhì)的親緣關(guān)系最遠；其次為品153柱花草，為0.685。其余材料的平均相似系數(shù)均大于0.700，其中Q10042、CIAT 1077和CIAT 1080最高，達0.796。

2.3 聚類分析結(jié)果

由圖2可知，14份糙柱花草種質(zhì)資源在相似系數(shù)為0.74處可明顯分為3大類群。第I類群包括10份材料，在相似系數(shù)為0.80處可分為2個亞類：I-A亞類包含6份材料，其中西卡柱花草和CIAT 66聚在一起，CPI 40292、CIAT 1077、CIAT 1077和CIAT 1080聚在一起；I-B亞類包含4份材料，其中Q10042與斯倫柱花草的親緣關(guān)系較近，而CPI 33260與費特羅雷柱花草的親緣關(guān)系更近。第II類群包括3份材料，在相似系數(shù)為0.80處，品153和TPRC 250可歸為II-A亞類，而CIAT 1355單獨歸為II-B亞類。第III類群僅1份材料CPI 93116，這份材料同其他供試材料的遺傳關(guān)系最遠。

3 討論與結(jié)論

分子標(biāo)記是作物遺傳學(xué)研究和分子育種的重要工具，相對于其他基于PCR的分子標(biāo)記，SSR標(biāo)記具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點，這使SSR技術(shù)在種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建、基因定位及遺傳圖譜的構(gòu)建等多個領(lǐng)域得以應(yīng)用[7]。糙柱花草是熱帶地區(qū)重要的放牧型豆科牧草，當(dāng)前糙柱花草SSR標(biāo)記的缺失極大地限制了人們對糙柱花草分子水平的認(rèn)識。SSR標(biāo)記的開發(fā)一般需要大量的堿基序列作為基礎(chǔ)，然而SSR引物在近緣種間具有一定的通用性，因此，對遺傳學(xué)基礎(chǔ)較弱的物種，近緣物種轉(zhuǎn)移法已成為一種成本低廉、簡便快速獲得SSR標(biāo)記的有效途徑[22]。鐘敏等[23]通過對1 205個綠豆SSR標(biāo)記進行篩選，獲得了603、883和983個分別在豇豆、小豆和飯中可用的SSR標(biāo)記。Sharma等[24]研究結(jié)果表明，98個水稻SSR標(biāo)記和20個甘蔗SSR標(biāo)記在竹子中的通用性比率分別為44.9%和75%。本課題組對123個在其他柱花草種中開發(fā)的SSR標(biāo)記進行了篩選，獲得了79個在糙柱花草中能有效擴增的SSR標(biāo)記[17]。利用其中16個SSR標(biāo)記對14份糙柱花草種質(zhì)資源的遺傳背景及親緣關(guān)系進行鑒定，結(jié)果表明，在16個SSR標(biāo)記中，有10個SSR標(biāo)記在14份糙柱花草材料中具有多態(tài)性，每個多態(tài)性標(biāo)記可檢測到2～8個等位基因，PIC值的變化范圍為0.173～0.769，平均為0.411。利用這10個多態(tài)性SSR標(biāo)記能夠有效地對14份糙柱花草種質(zhì)資源進行區(qū)別鑒定，表明利用近緣物種轉(zhuǎn)移法獲得的糙柱花草SSR標(biāo)記不僅具有較高的多態(tài)性，且能夠成功用于糙柱花草種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析。

由于柱花草屬植物分布廣泛、種類繁多、植物學(xué)特征復(fù)雜多變，所以基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征分類方法很難對柱花草屬內(nèi)種和亞種進行區(qū)分鑒定，所以許多學(xué)者通過分子標(biāo)記方法對柱花草種間遺傳關(guān)系進行了研究[25-26]。如灌木柱花草和糙柱花草有著非常相似的生態(tài)學(xué)特征，包括生長習(xí)性、莢果性狀、均為多年生等[27]，所以根據(jù)形態(tài)特征很難對它們進行區(qū)分，直到2002年，灌木柱花草才被確定為一個新種[28]。Chandra等[27]利用STS標(biāo)記和流式細胞儀從48份糙柱花草種質(zhì)資源中鑒定出10份灌木柱花草。Liu[1]利用RAPD標(biāo)記對100份糙柱花草資源進行分析，從中分離鑒定出7個錯誤種質(zhì)，將剩下的93份種質(zhì)分為5個類群，說明相對于形態(tài)學(xué)指標(biāo)，分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定中更有效。本研究利用16個SSR標(biāo)記對14份糙柱花草種質(zhì)進行了遺傳多樣性分析，將它們分為3個大類，5個小群，該結(jié)果與Liu的研究結(jié)果類似。14份糙柱花草種質(zhì)的來源和聚類結(jié)果并不一致，這可能是不同地區(qū)種質(zhì)資源互相交流的原因。

綜上所述，對于遺傳學(xué)基礎(chǔ)較弱的糙柱花草，利用同屬柱花草的SSR標(biāo)記來分析糙柱花草的遺傳信息，是一種成本低廉、簡便快速的有效途徑。本課題組利用近緣物種轉(zhuǎn)移法從其他柱花草中獲得了糙柱花草SSR標(biāo)記，本研究將其中16個條帶清晰且多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記成功應(yīng)用于糙柱花草種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析，能有效地對糙柱花草資源進行區(qū)分鑒定。本研究結(jié)果將有助于糙柱花草種質(zhì)資源遺傳多樣性、親緣關(guān)系鑒定、基因發(fā)掘與定位及分子輔助植物育種等研究的開展。

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