慢性阻塞性肺疾病患者外周血T淋巴細(xì)胞凋亡檢測(cè)的臨床價(jià)值

廖長(zhǎng)征，徐文莉，陳思祖

(深圳市龍崗中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518116)

摘要：目的探討慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血CD4`+、CD8`+ T細(xì)胞凋亡水平與肺功能的相關(guān)性。方法采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定30例COPD緩解期患者、30例COPD急性期患者及20名健康體檢者外周血CD4`+和CD8`+ T細(xì)胞凋亡水平，與第1秒用力呼出量占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)和FEV1/用力肺活量(FVC)水平作相關(guān)分析。結(jié)果COPD患者CD4`+ T細(xì)胞凋亡水平較健康對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，其中急性期顯著高于緩解期(P<0.05)；COPD患者CD8`+T細(xì)胞凋亡水平明顯低于健康對(duì)照組(P<0.01)，其中急性期明顯低于緩解期(P<0.05)。CD4`+ T細(xì)胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)；CD8`+ T細(xì)胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論CD4`+ 、CD8`+ T細(xì)胞凋亡水平與肺功能具有密切相關(guān)性，其水平變化可作為監(jiān)測(cè)COPD患者病情的重要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞凋亡；T淋巴細(xì)胞亞群；肺功能；慢性阻塞性肺疾病

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)10-0971-04R446.63

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.001

Abstract:ObjectiveTo investigate the correlation of the apoptosis of peripheral blood CD4`+ and CD8`+ T cells with lung function in chronic obstructive pulmonary disease (COPD)patients. MethodsA total of 30 stable COPD patients, 30 acute exacerbation COPD patients and 20 healthy subjects were enrolled. The apoptosis of peripheral blood CD4`+ and CD8`+ T cells was determined by flow cytometry. The correlation of T lymphocyte apoptosis with forced expiratory volume 1 second (FEV1%) and FEV1/forced vital capacity (FVC) was analyzed. ResultsThe CD4`+ T cell apoptosis of COPD group increased significantly with that of healthy control group(P<0.01), and that of acute exacerbation group was higher than that of stable group (P<0.05). The CD8`+ T cell apoptosis of COPD group was lower than that of healthy control group (P<0.01) . The CD8`+ T cell apoptosis of acute exacerbation group was lower than that of stable group(P<0.05). CD4`+ T cell apoptosis was negatively correlated with FEV1% and FEV1/FVC, and CD8`+ T cell apoptosis was positively correlated with FEV1% and FEV1/FVC (P<0.01). ConclusionsThe apoptosis of CD4`+ and CD8`+ T cells is closely related to lung function in COPD patients, which can be used as an indicator for the monitor of COPD.

作者簡(jiǎn)介：廖長(zhǎng)征，男，1971年生，副主任技師，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)工作。

收稿日期：(2014-12-04)

Clinical significance of peripheral blood T lymphocyte apoptosis determination for chronic obstructive pulmonary disease patientsLIAOChangzheng,XUWenli,CHENSizu.(CentralLoboratory,ShenzhenLonggangCentralHospital,GuangdongShenzhen518116,China)

Key words: Cell apoptosis；T lymphocyte subset；Lung function；Chronic obstructive pulmonary disease

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)居全球死亡病因第4位，目前其發(fā)病率和死亡率仍在逐漸增加，由于其患者數(shù)量多，死亡率高，社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，已成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題[1]。目前COPD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了，針對(duì)病理組織的研究認(rèn)為，炎癥導(dǎo)致COPD患者氣管壁的損傷與修復(fù)過程反復(fù)發(fā)生，進(jìn)而使氣管結(jié)構(gòu)重塑及瘢痕形成，導(dǎo)致肺組織受損，肺功能下降[2]。有文獻(xiàn)證實(shí)，細(xì)胞凋亡在COPD的發(fā)生、發(fā)展過程中起了重要作用[3-4]。作為在COPD發(fā)病中占重要地位的炎性細(xì)胞——T淋巴細(xì)胞的凋亡情況與肺功能的關(guān)系研究較少，本研究通過對(duì)COPD患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群凋亡水平及肺功能的測(cè)定，分析兩者間的相關(guān)性，以期了解其在COPD發(fā)病中的意義，為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.研究對(duì)象選擇深圳市龍崗中心醫(yī)院2013年1至12月呼吸科門診及住院就診的COPD患者60例，納入標(biāo)準(zhǔn)符合我國(guó)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2013年修訂版)[5]。排除支氣管哮喘、肺結(jié)核、支氣管擴(kuò)張、肺間質(zhì)纖維化、肺癌及肺部手術(shù)等病史；排除心、腦、腎及免疫系統(tǒng)疾病，且近期內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素類藥物。其中緩解期患者30例(COPD緩解期組1)，男17例，女13例，年齡(63±10)歲；急性發(fā)作期患者30例，男21例，女9例，年齡(62±9)歲，給予常規(guī)抗炎、平喘化痰治療，癥狀明顯緩解出院后，電話隨訪復(fù)診，其中20例符合入選標(biāo)準(zhǔn)，作為自身比較的緩解期組(COPD緩解期組2)。由于吸煙會(huì)影響呼吸功能[6-7]，健康對(duì)照組選擇在深圳市龍崗中心醫(yī)院行健康體檢結(jié)果無(wú)異常的非吸煙健康人群，共20名，男12名，女8名，年齡(59±10)歲。組間年齡、性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.儀器和試劑hypAir型肺功能儀(比利時(shí)Medisoft公司)，CH20BIMF2000光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，F(xiàn)ACS Calibar型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。7-氨基放線菌素D(7-amino-actinomycin D, 7-AAD)、鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V)-異硫氰基熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、抗CD4藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)、抗CD8-PE、Binding Buffer以及淋巴細(xì)胞分離液等均為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

二、方法

1.肺功能的測(cè)定受試者吸入400 μg沙丁胺醇后，采用Medi-soft肺功能儀按照操作標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定患者第1秒用力呼出量占預(yù)計(jì)值百分比(forced expiratory volume 1 second，F(xiàn)EV1%)和FEV1/用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)。

2.流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定T淋巴細(xì)胞亞群凋亡 受試者晨起抽取靜脈血4 mL(肝素抗凝)，樣本處理步驟按照說明書進(jìn)行操作以提取淋巴細(xì)胞，并將細(xì)胞濃度調(diào)整到105～106/mL間。分別取細(xì)胞懸液100 μL與CD4-PE 10 μL 或CD8-PE 10 μL、7-ADD 5 μL 以及Annexin V-FITC 5 μL均勻混合充分，置于室溫(20～25 ℃)避光15 min，加400 μL 1×Binding Buffer在1 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié)果

一、CD4 +和CD8 +T細(xì)胞凋亡率以及FEV1%、FEV1/FVC測(cè)定值水平間的比較

4組間CD4+、CD8+T細(xì)胞凋亡水平及FEV1%、FEV1/FVC測(cè)定值水平存在明顯差異，其中COPD急性期組CD4+T細(xì)胞凋亡水平最高，COPD緩解期組1和COPD緩解期組2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，總體COPD緩解期組次之，健康對(duì)照組最低；COPD急性期組CD8+T細(xì)胞凋亡水平及FEV1%、FEV1/FVC測(cè)定值最低，COPD緩解期組1和COPD緩解期組2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，總體COPD緩解期組次之，健康對(duì)照組最高。見表1、圖1和圖2。

表1　COPD組與健康對(duì)照組T淋巴細(xì)胞亞群凋亡率及肺功能指標(biāo)的比較

注：a圖為健康對(duì)照組；b圖為COPD緩解期組1；c圖為COPD急性期組；d圖為COPD緩解期組2 圖1　CD4 + T細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)散點(diǎn)圖

注：a圖為健康對(duì)照組；b圖為COPD緩解期組1；c圖為COPD急性期組；d圖為COPD緩解期組2 圖2　CD8 + T細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)散點(diǎn)圖

二、CD4 +和CD8 + T細(xì)胞凋亡與FEV1%、FEV1/FVC之間的相關(guān)性

CD4+T細(xì)胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈負(fù)相關(guān)，CD8+T細(xì)胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC呈正相關(guān)。見表2。

表2　CD4 +、CD8 + T細(xì)胞凋亡率與FEV1%、FEV1/FVC之間的相關(guān)性

討論

COPD是一種具有氣流受限不完全可逆呈進(jìn)行性發(fā)展的慢性呼吸系統(tǒng)疾病[8]，其病因極其復(fù)雜，與遺傳、環(huán)境以及遺傳與環(huán)境的交互作用相關(guān)，近年來(lái)細(xì)胞凋亡的研究日益受到重視，并有COPD的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞凋亡相關(guān)的報(bào)道[3-4,9]。

機(jī)體作為一個(gè)整體維持正常免疫功能狀態(tài)，有賴于各種免疫細(xì)胞特別是各類T細(xì)胞亞群之間的相互協(xié)調(diào)和制約，產(chǎn)生適度性免疫應(yīng)答。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞和免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，其中輔助性CD4+T淋巴細(xì)胞和抑制性CD8+T淋巴細(xì)胞對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮重要的細(xì)胞和體液免疫調(diào)節(jié)作用，機(jī)體正常免疫功能需要T淋巴細(xì)胞亞群保持相對(duì)的穩(wěn)定性，尤其CD4+/CD8+比值的穩(wěn)定，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)異常在COPD發(fā)病中起著重要作用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COPD患者外周血CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞凋亡失衡，造成了COPD患者T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)異常，因此在COPD免疫治療中也要注重細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。

肺功能檢查是判斷氣流受限的主要客觀指標(biāo)，F(xiàn)EV1%是中、重度氣流受限的良好指標(biāo)[13]，已有研究證明FEV1%、FEV1/FVC能穩(wěn)定地顯示COPD各分期肺功能水平[14]，本研究使用二者代表肺功能，經(jīng)Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CD4+、CD8+T細(xì)胞凋亡水平與FEV1%、FEV1/FVC存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)關(guān)系，CD8+T細(xì)胞凋亡水平與FEV1%、FEV1/FVC存在較強(qiáng)的正相關(guān)關(guān)系，這說明隨著CD4+T細(xì)胞凋亡水平的升高和CD8+T細(xì)胞凋亡水平的降低，肺功能逐漸下降。本研究結(jié)果顯示，COPD患者緩解期CD4+T細(xì)胞凋亡水平明顯高于健康對(duì)照組，急性期又高于緩解期，加之CD4+T細(xì)胞死亡增多，二者共同引起CD4+T細(xì)胞下降，從而影響表面帶有IgA的B淋巴細(xì)胞向分泌IgA的漿細(xì)胞轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下從而引發(fā)反復(fù)的呼吸道感染，感染使呼吸衰竭過早發(fā)生[15-16]。本研究結(jié)果還顯示，COPD患者緩解期CD8+T細(xì)胞凋亡水平明顯低于健康對(duì)照組，急性期又低于緩解期，即說明CD8+T細(xì)胞存在凋亡延遲。有研究顯示，凋亡延遲使CD8+T細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，從而表達(dá)高水平的穿孔素和增強(qiáng)的細(xì)胞毒活性[17]，引發(fā)肺組織的損傷，導(dǎo)致肺功能的下降，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜上所述，CD4+、CD8+T細(xì)胞凋亡水平與肺功能間具有較高的相關(guān)性，其濃度水平的檢測(cè)有望成為COPD病情診斷及療效判斷的有效指標(biāo)。

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(本文編輯：姜敏)