喬木　程碧軍　武華玉　吳彪　劉貴生　李良華　吳俊靜　彭先文　梅書棋

摘要：克隆了豬TCAP基因1 662 bp的啟動(dòng)子序列，序列分析發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域存在MyoD、MyoG、MEF2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并構(gòu)建了3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子超表達(dá)載體，分別與TCAP基因啟動(dòng)子載體共轉(zhuǎn)染PK細(xì)胞。結(jié)果表明，3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子使TCAP基因啟動(dòng)子活性升高，均正調(diào)控TCAP基因的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：豬；TCAP基因；轉(zhuǎn)錄因子；表達(dá)調(diào)控

中圖分類號(hào)：S828；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）24-6299-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.052

Abstract：In this study，1 662 bp sequence of pig TCAP gene promoter was cloned. Some specific transcription factor （MyoD， MyoG and MEF2） binding sites were found in TCAP gene promoter by bioinformatics analysis. Over-expression vectors of MyoD，MyoG and MEF2 were successfully constructed and transfected with promoter sequences， respectively. Detection analysis showed that TCAP promoter activity was significantly higher. The results indicated that transcription factors MyoD，MyoG and MEF2 could bind to the TCAP promoter sequences， and enhance its activity.

Key words：pig；TCAP gene； transcription factor； expression regulation

TCAP蛋白是一種在橫紋肌和心肌中特異性表達(dá)的蛋白，是肌聯(lián)蛋白激酶的作用底物[1]，其能調(diào)節(jié)肌原纖維的組裝和肌原纖維的翻轉(zhuǎn)[2]。研究表明，該基因與肌肉萎縮、心肌癥、肌肉營(yíng)養(yǎng)不良、心肌損傷等相關(guān)[3-5]。

基因表達(dá)調(diào)控研究是當(dāng)前分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是基因表達(dá)過程中最重要的第一步，轉(zhuǎn)錄因子是能與基因特定序列專一性結(jié)合，從而調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子[6]。轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中直接或間接地識(shí)別和結(jié)合在順式作用元件的核心序列上，參與調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。因此篩選與鑒定基因的轉(zhuǎn)錄因子成為研究基因表達(dá)調(diào)控最為重要的一步，并為研究基因表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

PK細(xì)胞由動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存（采用含10%熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于5% CO2孵育箱內(nèi)37 ℃常規(guī)培養(yǎng)）。pGL3-basic載體購(gòu)自Promega公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DMEM培養(yǎng)基、LipofectionAMINE2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)豬染色體序列設(shè)計(jì)引物TpF/TpR（表1），以大白豬基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增體系中各組分為50 ng模板DNA、1×PCR Mix、0.5 mmol/L PCR primers。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min。以TproF/TproR為引物，以TCAP基因啟動(dòng)子擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶MluⅠ和XhoⅠ（Fermentas， Japan）消化后，連接到pGL3-Basic載體。

根據(jù)MyoD （NCBI，No. GU249575.1）、MyoG（NCBI，No. AY921006.1）、MEF2（NCBI， No. DQ343149.1）基因的序列，分別設(shè)計(jì)引物MyoDF/MyoDR、MyoGF/MyoGR、MEF2F/MEF2R（表1），反應(yīng)程序同上，引物MyoD/MyoG PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Kpn Ⅰ-EcoRⅠ酶切，引物MEF2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Nhe Ⅰ-XhoⅠ酶切后，分別連接到pcDNA3.1載體。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

PK細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，接種于24孔板中，培養(yǎng)達(dá)到50%～60%融合后，在清潔的EP管中用無(wú)血清培養(yǎng)基OPTI-DMEM稀釋1 μL 質(zhì)粒DNA至60 μL，加入5 μL轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫下孵育5～10 min，同時(shí)用l mL PBS清洗24孔板中的細(xì)胞1次，EP管中加入350 μL含F(xiàn)BS血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，吹打2次混勻后立即加入到24孔板中，輕輕搖勻置37 ℃、5% CO2孵育箱培養(yǎng)6 h，吸走含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，并用1 mL PBS清洗細(xì)胞1次，裂解并收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。

1.4 熒光素酶活性測(cè)定

徹底吸去各孔培養(yǎng)基，用PBS沖洗3遍，每孔加入細(xì)胞裂解液110 μL，冰上孵育30 min，刮下細(xì)胞并迅速收集到冰預(yù)冷的1.5 mL微量離心管中。4 ℃下12 000 r/min離心2 min，取上清液。將熒光素酶底物分析緩沖液和收集的上清置于室溫。取10 μL熒光素酶底物和50 μL細(xì)胞裂解液加入96孔板，輕輕混勻后迅速放入HTS7000多孔板閱讀器，在激發(fā)波長(zhǎng)為430 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為550 nm條件下讀取熒光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬TCAP基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果

以大白豬基因組DNA為模板利用引物TF/TR進(jìn)行 PCR反應(yīng)，獲得1 662 bp的序列（圖1），經(jīng)過序列比對(duì)和啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件分析確定為TCAP基因的啟動(dòng)子序列。

2.2 豬TCAP基因啟動(dòng)子序列的生物信息學(xué)分析

運(yùn)用網(wǎng)站TFSEARCH（http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html）和TESS（http：//www.cbil.upenn.edu/cgi-bin/tess/tess）對(duì)豬TCAP基因啟動(dòng)子區(qū)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)存在MyoD、MyoG、MEF2和NF-？資B等調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖2）。

2.3 TCAP啟動(dòng)子表達(dá)載體的構(gòu)建

以大白豬TCAP基因啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用TproF/TproR引物擴(kuò)增，獲得1 428 bp片段，PCR產(chǎn)物和pGL3-basic載體經(jīng)MluⅠ和XhoⅠ酶切純化后連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（圖3）和測(cè)序鑒定，證實(shí)插入片段為目的片段。

2.4 MyoD、MyoG和MEF2超表達(dá)載體的構(gòu)建

以大白豬肌肉組織的cDNA為模板，利用MyoDF/MyoDR、MyoGF/MyoGR、MEF2F/MEF2R引物擴(kuò)增，分別獲得960、675、1 302 bp的片段，MyoD和MyoG經(jīng)限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ消化， MEF2經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheⅠ和XhoⅠ消化，連接到經(jīng)同樣酶切的pCDNA3.1載體中轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒經(jīng)雙酶切（圖4、圖5、圖6）和測(cè)序鑒定，證實(shí)插入片段為目的片段。

2.5 超表達(dá)載體與啟動(dòng)子載體的共轉(zhuǎn)染

將構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子超表達(dá)載體分別與啟動(dòng)子序列進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，TCAP基因啟動(dòng)子作為對(duì)照，發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子與TCAP基因啟動(dòng)子共轉(zhuǎn)染后，TCAP基因啟動(dòng)子活性分別升高了2～3倍（圖7），說(shuō)明豬MyoD、MyoG和MEF2正調(diào)控TCAP基因的表達(dá)。

3 小結(jié)與討論

骨骼肌的生成過程需經(jīng)過形態(tài)學(xué)、組織學(xué)的變化，產(chǎn)生各個(gè)階段的細(xì)胞譜系，并通過終末分化形成成肌細(xì)胞，再由這些成肌細(xì)胞經(jīng)過一系列的發(fā)育分化為肌纖維。成肌分化抗原MyoD、肌細(xì)胞生成素MyoG是調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化和控制骨骼肌生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)肌細(xì)胞分化和控制骨骼肌生成中起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[7]。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子MEF2是最早在骨骼肌管核中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，具有DNA的結(jié)合活性，與肌肉肌酸激酶啟動(dòng)子中特異序列結(jié)合，調(diào)節(jié)肌肉形成和骨骼肌發(fā)育[8]。MyoD、MyoG、MEF2 3個(gè)調(diào)控因子在肌肉的形成與發(fā)育過程中均起重要的調(diào)控作用。

對(duì)豬TCAP基因啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)，存在MyoD、MyoG、MEF2等調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，本研究將3個(gè)調(diào)節(jié)因子超表達(dá)共轉(zhuǎn)染TCAP基因啟動(dòng)子，使TCAP基因表達(dá)量顯著升高，因此可以推斷MyoD、MyoG、MEF2對(duì)TCAP基因存在正調(diào)節(jié)作用，是TCAP基因的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。

參考文獻(xiàn)：

[1] GREGORIO C C ， TROMBIT？魣S K， CENTNER T， et al. The NH2 terminus of titin spans the Z-disc：Its interaction with a novel 19-kD ligand （T-cap） is required for sarcomeric integrity[J]. Cell Biol， 1998，143：1013-1027.

[2] SCHRODER R， REIMANN J， IAKOVENKO A， et al. Early and selective disappearance of telethonin protein from the sarcomere in neurogenic atrophy[J]. Journal of Muscle Research and Cell Motility， 2001， 22：259-264.

[3] MOREIRA E S， WILTSHIRE T J， FAULKNER G， et al.Limb-girdle muscular dystrophy type 2G is caused by mutations in the gene encoding the sarcomeric protein telethonin[J]. Nat Genet，2000，24（2）：163-166.

[4] KNOLL R， HOSHIJIMA M， HOFFMAN H M， et al. The cardiac mechanical stretch sensor machinery involves a Z disc complex that is defective in a subset of human dilated cardiomyopathy[J]. Cell， 2002，111（7）：943-955.

[5] BOS J M， POLEY R N， NY M， et al.Genotype-phenotype relationships involving hypertrophic cardiomyopathy associated mutations in titin， muscle LIM protein， and telethonin[J]. Mol Genet Metab，2006，88（1）：78-85.

[6] 李 潔.植物轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控[J].生物學(xué)通報(bào)，2004，39（3）：9-11.

[7] 邱華玲，于建興，陳宏權(quán).MyoG基因結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].生物信息學(xué)，2007，5（4）：190-193.

[8] 程 波，李 莉，王林杰.MEF2基因家族的研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧雜志，2012，48（15）：70-74.