·基礎(chǔ)研究·

miR302/367簇對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制探討

廖娟，雎巖，趙金，李潔，李濤

(陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西咸陽710061)

摘要：目的探討miR302/367簇在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及機(jī)制。方法通過實時定量PCR檢測肝癌細(xì)胞系(Bel-7402、HepG2、MHCC97、SMMC-7721)中miR302/367簇的表達(dá)；在HepG2、MHCC97肝癌細(xì)胞系中建立miR302/367簇過表達(dá)體系，通過細(xì)胞計數(shù)實驗、MTT實驗和異種移植瘤模型檢測肝癌細(xì)胞體內(nèi)、體外增殖和生長能力；利用流式細(xì)胞術(shù)，通過PI染色，檢測肝癌細(xì)胞周期分布。結(jié)果miR302/367簇在四個肝癌細(xì)胞系中均不表達(dá)；過表達(dá)miR302/367簇后，肝癌細(xì)胞體內(nèi)、體外的增殖和生長能力均明顯受抑制，其G0/G1期比例顯著增加，而S期比例明顯減少(P均<0.05)。結(jié)論 miR302/367簇通過阻滯細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

關(guān)鍵詞：肝腫瘤；微小RNA；miR302/367簇；細(xì)胞增殖

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.012

中圖分類號：R735.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-09-08)

肝癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，癌基因的激活和抑癌基因的失活是細(xì)胞發(fā)生癌變的主要機(jī)制。近年研究表明，miRNA參與了細(xì)胞的增殖、分化與凋亡等生理過程，其表達(dá)異常與腫瘤的起源與進(jìn)展密切相關(guān)[1]。已有大量報道顯示，miRNA在肝癌組織中表達(dá)異常，如miR16、miR21、miR31、miR122、miR145等，與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)[2, 3]。然而，miR302/367簇在肝細(xì)胞癌中的作用及分子機(jī)制目前尚不明確，本研究進(jìn)行了相關(guān)探討。

1材料與方法

1.1材料細(xì)胞：人肝癌細(xì)胞系Bel-7402、HepG2、MHCC97、SMMC-7721和畸胎瘤細(xì)胞系PA-1購自美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)，用含10%胎牛血清、1 000 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素的RPMI1640或DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)，待單層細(xì)胞生長達(dá)80%融合時，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞備用。試劑及儀器：細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI1640和DMEM購自Gibco BRL公司；氨芐青霉素鈉，硫酸鏈霉素和G418試劑購自美國Sigma公司；胎牛血清購自Hyclone公司；TRIzol，轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體(LipofectaminTM2000)購自Invitrogen公司；microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒均購自美國Applied Biosystems公司。

1.2載體構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR302/367簇位于人4號染色體4q25，包括miR302b、miR302c、miR302a、miR302d和miR367 5種miRNA[4]。從人肝癌細(xì)胞系HepG2基因組DNA中克隆了一段長723 bp的序列，將目的片段插入到miR-367前體miRNA的過表達(dá)載體(pCAG-EGFP-Neo)中并測序鑒定，構(gòu)建miR302b、c、a、d和pCAG-EGFP-Neo。收集對數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞，將5×105的細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h。根據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書，將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectmine2000與miR302/367簇過表達(dá)載體(實驗組)或pCAG-EGFP-Neo載體(對照組)混合，轉(zhuǎn)染24 h后觀測熒光，同時以1∶10的比例將每組細(xì)胞傳代，用G418藥物篩選挑取單克隆，通過實時定量PCR檢測其表達(dá)。

1.3細(xì)胞cDNA中miR302/367簇的檢測采用實時定量PCR法檢測肝癌細(xì)胞系(Bel-7402、HepG2、MHCC97和SMMC-7721)cDNA中miR302/367簇的表達(dá)，并選取畸胎瘤細(xì)胞系PA-1作為陽性對照。為進(jìn)一步研究miR302/367簇在肝癌細(xì)胞中的作用，我們在HepG2和MHCC97細(xì)胞系中建立miR302/367簇過表達(dá)體系，并采用同樣方法檢測miR302/367簇的表達(dá)。收集對數(shù)期生長細(xì)胞，根據(jù)TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，并利用特異性miRNA引物及TaqMan?miRNA reverse transcription kit反轉(zhuǎn)錄總RNA。利用TaqMan microRNA assay 和TaqMan universal PCR master mix試劑盒檢測cDNA中miR302/367簇的表達(dá)，其表達(dá)水平采用2-ΔCt方法，高度保守的snRNA U6作為內(nèi)參。結(jié)果在這4個肝癌細(xì)胞系中，miR302/367簇中5種miRNA均不表達(dá)，而在PA-1中均高表達(dá)。轉(zhuǎn)染miR302/367簇后，GFP陽性克隆均能表達(dá)5種miRNA。將過表達(dá)克隆(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)與對照克隆(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)用于后續(xù)研究。

1.4體外細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞活力檢測細(xì)胞增殖能力檢測：采用細(xì)胞計數(shù)實驗。收集對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×104個細(xì)胞接種于6孔板中，利用細(xì)胞計數(shù)器檢測1周內(nèi)細(xì)胞數(shù)并繪制細(xì)胞生長曲線，比較實驗組(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)和對照組(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)中細(xì)胞增殖能力的差異。細(xì)胞活力檢測:采用MTT法。將1 000個細(xì)胞接種于96孔板中，加入MTT后37 ℃培養(yǎng)4～6 h，然后加入DMSO溶解，用分光光度計于570 nm處測定吸光度并繪制曲線圖。連續(xù)7 d檢測細(xì)胞活力。

1.5體內(nèi)細(xì)胞增殖、生長和成瘤能力檢測采用異種移植瘤實驗。取對數(shù)生長期的實驗組(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)和對照組(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)中細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度，終濃度為1×106/mL，將100 μL(1×105個)細(xì)胞懸液接種于4～6周齡的BALB/c-nu裸鼠(購自上海斯萊克公司)雙側(cè)背部皮下，連續(xù)觀察6～8周，每周觀察腫瘤的生長情況并記錄。

1.6細(xì)胞周期檢測取對數(shù)生長期的實驗組(HepG2-302/367組和MHCC97-302/367組)和對照組(HepG2-EGFP組和MHCC97-EGFP組)中細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)，通過PI染色，檢測肝癌細(xì)胞周期分布。

2結(jié)果

2.1miR302/367簇對肝癌細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞活力的影響miR302/367簇干預(yù)后肝癌細(xì)胞的增殖能力明顯受抑。7 d的培養(yǎng)期中，HepG2-302/367和MHCC97-302/367與HepG2-EGFP和MHCC97-EGFP相比，其細(xì)胞數(shù)分別下降了3倍和2倍(P均<0.05)。結(jié)果見表1。MTT實驗亦顯示miR302/367簇能明顯抑制肝癌細(xì)胞生長。通過7 d的培養(yǎng)，HepG2-302/367和MHCC97-302/367與對照相比，其細(xì)胞活力均明顯降低(P均<0.05)。結(jié)果見表2。

表1　各組不同時間的細(xì)胞數(shù)比較(×10 4個，

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

表2　各組不同時間的細(xì)胞活力比較(吸光度值， ± s)

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

2.2miR302/367簇對肝癌細(xì)胞體內(nèi)增殖、生長和成瘤能力的影響過表達(dá)miR302/367簇后，肝癌細(xì)胞成瘤時間、成瘤率并未見明顯變化，HepG2-302/367、MHCC97-302/367實驗組和HepG2-EGFP、MHCC97-EGFP對照組在3周左右均可觸摸到結(jié)節(jié)，成瘤率均為100%。但與對照組相比，過表達(dá)組移植瘤的生長速度明顯減慢(表3，P<0.05)。裸鼠處死后取下腫瘤稱重，HepG2-302/367組和HepG2-EGFP組體質(zhì)量分別為(1.37±0.57)、(2.72±0.92)g，MHCC97-302/367組和MHCC97-EGFP組體質(zhì)量分別為(1.16±0.53)、(1.93±0.77)g，miR302/367簇過表達(dá)后體質(zhì)量明顯減輕(P<0.05)。

表3　各組不同時間的腫瘤體積比較 ± s)

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

2.3miR302/367簇對肝癌細(xì)胞周期的影響結(jié)果見表4。

3討論

miRNA是一種細(xì)胞內(nèi)源性的非編碼小RNA，長19～22 nt，可通過特異性結(jié)合來降解mRNA或抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)[5]。已有實驗證實，miRNA參與細(xì)胞的多種生理和病理過程，如細(xì)胞分化、增殖、凋亡及腫瘤形成等[5]。miR302/367簇能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞的多潛能性，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究旨在研究該基因簇在肝癌中的作用及機(jī)制。

表4　各組細(xì)胞周期分布比例比較 ± s)

注：與HepG2-EGFP組比較，*P<0.05；與MHCC97-EGFP組比較，#P<0.05。

miR302/367簇包括5個miRNA(miR302b、miR302c、miR302a、miR302d和miR367)。由于miR302a-d具有相同的種子序列，與miR367存在不同，因此大部分的文獻(xiàn)均只研究miR302s[6,7]，僅有為數(shù)不多的文獻(xiàn)報道了miR302/367簇的功能[8,9]。該基因簇中的5個miRNA位于同一前體miRNA，其共轉(zhuǎn)錄本由共同的啟動子調(diào)控轉(zhuǎn)錄，該啟動子位于Larp7基因的8號內(nèi)含子[10]。因此，這5個miRNA表達(dá)一致，應(yīng)作為一個整體共同研究其功能。我們前期研究結(jié)果顯示，4個肝癌細(xì)胞系中均不表達(dá)5個miRNA，而在畸胎瘤細(xì)胞系中均有表達(dá)，且表達(dá)水平一致。Suh等也報道了miR302/367簇在多潛能細(xì)胞中的特異性表達(dá)。

關(guān)于miR302s功能研究有不同的結(jié)果。有報道顯示，miR302s能誘導(dǎo)人體細(xì)胞(成纖維細(xì)胞和毛囊濾泡細(xì)胞)和腫瘤細(xì)胞(Colo-829 黑色素瘤和PC3前列腺癌)形成誘導(dǎo)多能活細(xì)胞[7]，而另一部分報道顯示miR302s能抑制人多潛能干細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞的成瘤能力。同樣的，miR302/367簇亦能誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞形成多潛能胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞[8]。在本研究中，我們并未發(fā)現(xiàn)miR302/367簇在肝癌細(xì)胞中具有重編程作用，但能通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)程從而抑制肝癌細(xì)胞增殖。在肝癌細(xì)胞系中過表達(dá)miR302/367簇后，可抑制細(xì)胞體內(nèi)、外增殖和生長能力，這一過程是通過阻滯細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換實現(xiàn)的。

在以往的研究中，亦有文獻(xiàn)報道了miR302/367簇抑制周期進(jìn)程的分子機(jī)制。miR302s能下調(diào)多種細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，包括CDK2、cyclin A、E2F-1、cyclin D1等[11]。在宮頸癌中，miR302/367簇能通過直接靶向AKT1，上調(diào)p27Kip1和p21Cip1這兩個周期抑制蛋白，從而阻滯細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換[15]。

綜上所述，miR302/367簇能通過阻滯細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌基因的作用。該研究為進(jìn)一步探索肝癌的生物學(xué)機(jī)制及將miR302/367簇作為潛在的治療靶點提供了理論基礎(chǔ)。

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