他克莫司對小鼠腸黏膜屏障功能的損傷作用及分子機(jī)制

呂亞青1，曲林林1，江海濤1，黎介壽2

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島266555；2南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)

摘要：目的觀察他克莫司(FK506)對小鼠腸黏膜屏障功能的損傷作用，并探討其分子機(jī)制。方法將24只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為高劑量組、低劑量組和對照組各8只，分別予FK506 5 mg/kg、FK506 1 mg/kg、生理鹽水灌胃。用藥30 d處死小鼠，收集腸黏膜組織標(biāo)本，采用HE染色法觀察腸黏膜組織結(jié)構(gòu)變化，透射電鏡下觀察腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接的超微結(jié)構(gòu)改變，采用分光光度法測定血漿D-乳酸，氧電極法測定腸組織線粒體呼吸功能，高壓液相色譜法檢測腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體三磷酸腺苷(ATP)酶活性。結(jié)果低、高劑量組小鼠體質(zhì)量較對照組明顯減輕，高劑量組減輕更明顯(P均<0.05)；低、高劑量組小鼠腸上皮細(xì)胞間緊密連接超微結(jié)構(gòu)遭到破壞，其損傷程度與FK506劑量呈正相關(guān)；與對照組比較，低、高劑量組小鼠血漿D-乳酸水平升高，高劑量組升高更明顯(P均<0.05)；與對照組比較，低、高劑量組小鼠小腸3態(tài)呼吸耗氧量、呼吸控制率、膜電位、ATP酶活性下降，4態(tài)呼吸耗氧量升高，高劑量組變化更明顯(P均<0.05)。結(jié)論 FK506能損傷小鼠腸黏膜屏障功能，且損傷程度呈劑量依賴性；其分子機(jī)制可能是通過損傷小鼠腸黏膜細(xì)胞線粒體功能而損傷腸黏膜屏障功能。

關(guān)鍵詞：腸黏膜屏障；他克莫司；線粒體；小鼠

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.45.004

中圖分類號(hào)：R333.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

基金項(xiàng)目：山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)

作者簡介：第一呂亞青(1976-)，女，主管護(hù)師，主要研究方向?yàn)閲中g(shù)期腸屏障功能保護(hù)。E-mail:uuto2004@126.com

作者簡介：通信黎介壽(1923-)，男，中國工程院院士，醫(yī)學(xué)博士，主要研究方向?yàn)槲改c外科疾病的診治。E-mail:lijieshounju@126.com

收稿日期：(2015-08-01)

Damaging effect of FK506 on intestinal mucosal barrier function

in mice and its molecular mechanism

LYUYa-qing1, QU Lin-lin, JIANG Hai-tao, LI Jie-shou

(1TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266555,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the damaging effect of tacrolimus (FK506) on intestinal mucosal barrier function in mice and to investigate its possible molecular mechanisms. MethodsTwenty-four C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups (8 in each group): high-dose group (5 mg/kg), low-dose group (1 mg/kg) and the control group (normal saline). All mice were sacrificed after FK506 was administered for 30 days and the intestinal mucosal tissues were obtained. The structure of intestinal mucosa was observed by HE staining and ultrastructure was observed by transmission electron microscope. The level of D-lactate was detected by spectrophotometry. The function of mitochondrion was detected with Clark electrodes. The adenosine triphosphate (ATP) was detected with high pressure liquid chromatography. ResultsThe body weight of mice was decreased significantly in the high-dose and low-dose groups as compared with that of the control group, and the body weight lost more in the high-dose group than in the low-dose group (all P<0.05). The ultrastructure of intestinal mucosa was destroyed in high-dose and low-dose groups and it showed a dose-dependent manner. Compared with the control group, the level of D-lactate was increased significantly in the high-dose and low-dose groups and it was more significant in the high-dose group (all P<0.05). Compared with the control group, state Ⅲ oxygen consumption, respiratory control ratio, membrane potential and enzymatic activity of ATP were decreased significantly and state Ⅳ oxygen consumption was increased significantly in the high-dose and low-dose groups, and the changes were more significant in the high-dose group than in the low-dose group (all P<0.05). ConclusionFK506 could destroy the intestinal mucosal barrier function with a dose-dependent manner, and the molecular mechanism may be caused by destruction of the mitochondrion of intestinal mucosal cells.

Key words: intestinal mucosal barrier; tacrolimus; mitochondrion; mice

目前，對抗器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)主要應(yīng)用免疫抑制劑[1]，其中他克莫司(FK506)作為一種強(qiáng)效免疫抑制劑被廣泛應(yīng)用[2,3]，其通過抑制T輔助(Th)細(xì)胞釋放白細(xì)胞介素-2、抑制細(xì)胞毒T細(xì)胞增殖達(dá)到免疫抑制作用[4]。但FK506同時(shí)亦有較強(qiáng)的不良反應(yīng)，特別是在大劑量使用時(shí)可發(fā)生難以控制的感染[5]，而感染是器官移植失敗甚至患者死亡的主要原因之一[6]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506能造成小鼠腸黏膜屏障功能損傷，然而其具體機(jī)制仍不明確。2013年3～7月，我們觀察了FK506對小鼠腸黏膜屏障功能的損傷作用，并探討其分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1 材料4周齡C57BL/6雄性小鼠24只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)，體質(zhì)量16～19 g。FK506膠囊購自安斯泰來制藥(中國)有限公司。血漿D-乳酸檢測試劑盒購自杰美公司，ATP酶試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司。JEM-1200透射電鏡購自日本電子JEOL公司，氧電極購自英國Hansatech公司。

1.2造模及分組將24只小鼠隨機(jī)分為對照組、高劑量組、低劑量組，每組8只。將FK506完全溶于生理鹽水制成0.25、0.05 mg/mL溶液，高劑量組小鼠胃內(nèi)灌注FK506 5 mg/kg，低劑量組胃內(nèi)灌注FK506 1 mg/kg，每天連續(xù)給藥，7 d后隔天給藥至30 d。對照組每天胃內(nèi)灌注相同容積的生理鹽水。用藥期間觀察小鼠的一般情況(體質(zhì)量、有無腹瀉等)。于給藥30 d麻醉小鼠行腹正中切口取材，手術(shù)過程中腹腔內(nèi)適量滴生理鹽水，保持組織活性。

1.3腸黏膜組織病理學(xué)觀察取回盲部靠近回腸部1 cm腸管，于等滲鹽水中洗凈腸內(nèi)容物。組織標(biāo)本用10%甲醛固定待行病理學(xué)檢查，采用HE染色，光鏡下觀察。

1.4腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)觀察取回盲部近結(jié)腸部約1 mm×1 mm×3 mm腸段，快速固定于3%的冷戊二醛溶液中2 h，1%鋨酸固定1 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，Epon-812樹脂包埋，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-1200透射電鏡下觀察腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接的超微結(jié)構(gòu)改變。

1.5血漿D-乳酸檢測于給藥30 d心臟穿刺取血1.5 mL，新鮮血液標(biāo)本離心(400 g，10 min)后，采用分光光度法測定血漿D-乳酸。

1.6腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體功能檢測給藥30 d后麻醉小鼠，行腹正中切口獲取小鼠回腸組織，用差速離心法分離小鼠回腸組織線粒體，按1 g組織∶9 mL分離介質(zhì)的比例加入線粒體分離介質(zhì)，組織剪碎后勻漿，低溫離心，洗滌沉淀2次。洗滌后線粒體沉淀加300 μL分離介質(zhì)溶解制成線粒體混懸液。采用氧電極法測定線粒體呼吸功能。反應(yīng)總體積800 μL，設(shè)置溫度為30 ℃。調(diào)節(jié)反應(yīng)介質(zhì)氧含量至高點(diǎn)并調(diào)節(jié)氧含量至0點(diǎn)，穩(wěn)定后，向反應(yīng)池中依次加入線粒體懸液100 μL，反應(yīng)底物蘋果酸鈉(1.25 mol/L)10 μL和谷氨酸鈉(1.25 mol/L)10 μL，間隔約1 min后加入腺苷二磷酸(ADP)(40 mmol/L)5 μL，觀察線粒體呼吸態(tài)的變化。記錄氧耗曲線。計(jì)算在ADP加入后3態(tài)呼吸(ST3)和ADP耗盡后4態(tài)呼吸(ST4)的氧耗量。線粒體呼吸活性以消耗線粒體蛋白表示，呼吸控制率(RCR)以3、4態(tài)耗氧之比(ST3/ST4)表示。采用羅丹明123作為熒光探針測定線粒體膜電位，線粒體膜電位=59×log([羅丹明123濃度]線粒體內(nèi)/[羅丹明123濃度]線粒體外)。

1.7腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體腺苷三磷酸(ATP)酶活性檢測采用高壓液相色譜法。將差速離心法分離所得小鼠回腸組織線粒體懸液嚴(yán)格按ATP酶試劑盒說明書操作。定義每小時(shí)每毫克組織蛋白中ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1個(gè)ATP酶活力單位。

2結(jié)果

2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況低、高劑量組小鼠體質(zhì)量較對照組明顯減輕，給藥劑量越大體質(zhì)量增加越緩慢。低劑量組、高劑量組小鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉癥狀。

2.2小腸黏膜組織病理學(xué)變化光鏡下可見低、高劑量組小鼠的小腸絨毛粗糙，腸黏膜與腸黏膜下層充血、水腫、糜爛，并伴有炎性細(xì)胞浸潤，低劑量組黏膜損傷程度輕于高劑量組。

2.3腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接超微結(jié)構(gòu)改變透射電鏡下可見低劑量組小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接間隙增寬，結(jié)構(gòu)模糊；高劑量組小鼠腸黏膜緊密連接不僅出現(xiàn)間隙增寬、結(jié)構(gòu)破壞，其橋粒結(jié)構(gòu)亦消失。

2.4血漿D-乳酸水平變化對照組、低劑量、高劑量組小鼠血漿D-乳酸水平分別為(0.43±0.07)、(0.81±0.02)、(0.22±0.03)mmol/L，與對照組比較，低、高劑量組小鼠血漿D-乳酸水平升高，高劑量組升高更明顯(P均<0.05)。

2.5腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體呼吸功能變化及ATP酶活性結(jié)果見表1。

表1　三組小鼠小腸線粒體呼吸功能比較 ± s)

注：與對照組相比，*P<0.05；與低劑量組相比，#P<0.05。

3討論

隨著免疫抑制劑的臨床應(yīng)用,器官移植術(shù)后急性排斥反應(yīng)得到了較好控制[7]，但移植術(shù)后的其他問題逐漸顯現(xiàn)出來。腸道是人體內(nèi)最大的貯菌庫，在移植術(shù)后，因腸黏膜屏障功能受損導(dǎo)致的細(xì)菌移位可造成嚴(yán)重的菌血癥、毒血癥、敗血癥等，甚至導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征，成為小腸移植手術(shù)失敗的主要原因之一[8]。

FK-506為一種新型強(qiáng)效免疫抑制劑，可致腸黏膜屏障功能損傷，但損傷的機(jī)制仍不明確。有研究認(rèn)為，腸黏膜屏障功能的維持可能呈能量依賴性[9]。當(dāng)細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙時(shí)主要表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降，ATP是體內(nèi)最重要的高能化合物，亦是各種生命活動(dòng)能量的直接供應(yīng)者。細(xì)胞內(nèi)80%以上的ATP在線粒體合成，線粒體功能障礙將致ATP合成受阻，造成細(xì)胞內(nèi)各種合成反應(yīng)中斷、氧自由基生成增加及細(xì)胞膜穩(wěn)定性受到破壞、細(xì)胞凋亡增加等嚴(yán)重后果[10]。而腸黏膜上皮細(xì)胞更新迅速，其對能量的供應(yīng)變化極其敏感，當(dāng)ATP生成障礙時(shí)，將造成腸黏膜上皮細(xì)胞的大量凋亡，腸黏膜屏障功能無法維持，腸黏膜通透性增加[11]。腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是相鄰腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，其封閉了相鄰腸黏膜細(xì)胞間的空隙，能阻止大分子物質(zhì)由此通過，其構(gòu)成與解離亦受到能量代謝的影響[12,13]。因此，F(xiàn)K-506導(dǎo)致的細(xì)胞能量代謝障礙將造成腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接發(fā)生破壞，表現(xiàn)為腸屏障功能受損。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用FK-506后小鼠血漿D-乳酸水平明顯上升，提示腸黏膜通透性增加，同時(shí)可觀察到腸黏膜上皮緊密連接發(fā)生改變。

FK-506造成線粒體功能受損，導(dǎo)致能量生成障礙，其可能的作用機(jī)制：①線粒體氧化磷酸化脫偶聯(lián)。氧化磷酸化是與電子傳遞過程偶聯(lián)的磷酸化過程，是ADP被磷酸化生成ATP的酶促過程,亦是合成ATP的主要途徑。線粒體氧化磷酸脫偶聯(lián)后,磷酸化過程受阻,電子傳遞過程中將不能產(chǎn)生ATP。②增加線粒體中氧自由基的產(chǎn)生。氧自由基主要來源于線粒體呼吸鏈反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)90%以上的氧自由基由此產(chǎn)生。在正常情況下，電子通過呼吸鏈傳遞給O2生成H2O。當(dāng)線粒體功能下降時(shí)，O2不能被有效利用，導(dǎo)致大量電子漏出，與O2反應(yīng)生成氧自由基。氧自由基使生物膜中的多不飽和脂肪酸(PUFA)過氧化，導(dǎo)致生物膜中PUFA含量明顯減少，膜的液態(tài)性、流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變[14]。

本研究中我們觀察到FK506造成腸黏膜上皮細(xì)胞線粒體功能破壞，導(dǎo)致腸黏膜上皮細(xì)胞間緊密連接破壞，腸屏障功能受到損傷，且損傷程度呈劑量依賴性；其分子機(jī)制可能是通過損傷小鼠腸黏膜細(xì)胞線粒體功能而損傷腸黏膜屏障功能。

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