金標(biāo)法與CLEIA聯(lián)合應(yīng)用提高HBsAg檢測(cè)的準(zhǔn)確性

王 科，陳 睿，胡恩赑，王 樹(shù)

目的 觀察金標(biāo)法與化學(xué)發(fā)光酶免分析(CLEIA)一步法聯(lián)合應(yīng)用，消除CLEIA檢測(cè)HBsAg假低值結(jié)果。方法 CLEIA檢測(cè)出HBsAg陽(yáng)性的標(biāo)本用金標(biāo)法篩選出質(zhì)控線明顯低于檢測(cè)線的10例標(biāo)本，再用純水做稀釋劑稀釋原標(biāo)本血清，用CLEIA法檢測(cè)稀釋后的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)作為最終HBsAg結(jié)果。結(jié)果 經(jīng)篩選的10例標(biāo)本經(jīng)稀釋后結(jié)果明顯高于原倍檢測(cè)結(jié)果。結(jié)論 金標(biāo)法能夠篩選CLEIA法中鉤狀效應(yīng)的標(biāo)本，用純水作為稀釋劑稀釋原標(biāo)本能很好的消除鉤狀效應(yīng)帶來(lái)的假低值，提高科美Chemclin 600檢測(cè)HBsAg的準(zhǔn)確性。

乙型肝炎表面抗原;金標(biāo)法;化學(xué)發(fā)光酶免分析;鉤狀效應(yīng);假低值;稀釋

HBsAg是HBV感染后較早出現(xiàn)在血清中的抗原，被認(rèn)為是病毒感染的標(biāo)志，受到臨床醫(yī)生和人們較高的重視。以科美Chemclin 600為代表的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析(CLEIA)方法，使得人們對(duì)兩對(duì)半指標(biāo)有了量化認(rèn)識(shí)，采用一步法檢測(cè)HBsAg，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高工作效率。在免疫學(xué)中，無(wú)論是定性還是定量檢測(cè)，采用一步法中都存在影響最終結(jié)果的主要因素之一———鉤狀效應(yīng)。我們對(duì)金標(biāo)法與CLEIA聯(lián)合應(yīng)用，消除降低鉤狀效應(yīng)帶來(lái)的假低值結(jié)果進(jìn)行了觀察，旨在提高科美Chemclin 600對(duì)HBsAg檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1 資料與方法

1．1資料 2014年9月18日－2014年11月3日免疫室日常工作期間，科美Chemclin 600檢測(cè)出HBsAg陽(yáng)性標(biāo)本，再用金標(biāo)試紙條檢測(cè)對(duì)應(yīng)標(biāo)本的血清，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)，查看結(jié)果，在金標(biāo)試紙條上質(zhì)控線明顯低于檢測(cè)線的標(biāo)本共10例。

1．2方法 儀器及試劑: (1)儀器:北京科美Chemclin 600。(2)試劑:化學(xué)發(fā)光試劑為科美Chemclin 600配套試劑，金標(biāo)

對(duì)照組出現(xiàn)切口紅腫13例，發(fā)生率為28．89%，切口感染6例，發(fā)生率13．33%，切口愈合時(shí)間為(12．36±4．27)d;觀察組出現(xiàn)切口紅腫6例，發(fā)生率為13．33%，切口感染1例，發(fā)生率為2．20%，切口愈合時(shí)間(7．26±3．86)d。切口感染率2組比較，觀察組明顯低于對(duì)照組(P＜0. 05)，觀察組在愈合時(shí)間上明顯較對(duì)照組縮短(P＜0．05)。

表1 切口感染的發(fā)生情況及切口愈合時(shí)間比較(珋x±s)

3 討論

急性闌尾炎是普通外科較為常見(jiàn)的一種急腹癥，發(fā)病原因多為細(xì)菌入侵、闌尾官腔阻塞等[3]。手術(shù)切除闌尾是目前認(rèn)為最有效的治療方法，但術(shù)后切口感染發(fā)生率較高，尤其是急性壞疽穿孔性闌尾炎合并腹膜炎者術(shù)后切口感染發(fā)生率更高[4]，這一直是困擾普外科醫(yī)生的難題，給醫(yī)患雙方增加了一定的心理壓力。造成闌尾炎術(shù)后切口感染的原因較多，歸納起來(lái)有以下幾個(gè)方面: (1)患者年齡、腹壁脂肪厚度，基礎(chǔ)疾病的情況如糖尿病患者，貧血等。(2)闌尾炎病理類型，腹腔感染程度，闌尾炎明確診斷后至手術(shù)時(shí)間。(3)術(shù)中切口是否進(jìn)行有效的保護(hù)則是切口感染的重要因素，合適的手術(shù)切口，合理使用電刀，確切止血等嫻熟手術(shù)技能均可減少切口感染的發(fā)生。(4)對(duì)于感染重的闌尾炎，腹腔有膿性滲液時(shí)應(yīng)用生理鹽水曬布蘸盡，或者沖洗腹腔，并放置腹腔引流管，保持引流管通暢，術(shù)后根據(jù)情況拔除。(5)手術(shù)操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，縫合創(chuàng)面時(shí)沒(méi)有進(jìn)行徹底沖洗，有效的引流，手術(shù)局部組織缺血再灌注損傷加劇，減少局部組織的抗菌能力，由于長(zhǎng)時(shí)間暴露，使周圍的空氣和手術(shù)切口毛囊內(nèi)細(xì)菌進(jìn)入到手術(shù)切口，從而增加手術(shù)切口污染的機(jī)會(huì)。

針對(duì)上述切口感染的原因，結(jié)合臨床工作中的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，在經(jīng)腹闌尾炎術(shù)后皮下放置自制負(fù)壓引流器(注射器負(fù)壓連接套管針)進(jìn)行引流，其操作簡(jiǎn)單易行，留置針不易打折，在持續(xù)負(fù)壓的作用下，可有效引流組織滲液、滲血，引流效果好。而皮下埋置的靜脈輸液針頭很細(xì)，長(zhǎng)時(shí)間包埋無(wú)明顯異物感及排斥反應(yīng)，可持續(xù)引流，且體積小，重量輕，對(duì)患者圍手術(shù)期的生活影響小。本方法也同樣適用于其它疾患可能有空腔及皮下積液創(chuàng)面中，可有效降低切口感染率，減少或避免因術(shù)后切口感染帶來(lái)的軀體與精神痛苦，減輕患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，在切口感染防治方法具有一定的實(shí)際意義，值得臨床推廣。

[1]吳 養(yǎng)，楊雪英，吳春輝，等．外科手術(shù)切口感染調(diào)查及對(duì)策[J]．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006，16(7):758-760．

[2]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部．醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)(試行)[S]．北京:中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2001:10-12．

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[4]吳階平，裘法祖．黃家駟外科學(xué)[M]．第6版．北京:人民衛(wèi)生出版社，1999:1151-1152．試紙條為杭州艾博生物醫(yī)藥有限公司提供，稀釋劑為杭州惠邦凈水設(shè)備有限公司HB－RO/120型反滲透純水機(jī)制造的純水。操作嚴(yán)格按SOP要求進(jìn)行。采用科美Chemclin 600化學(xué)發(fā)光酶免分析(chemiluminescent enzyme immuneassay，CLEIA)一步法對(duì)期間的標(biāo)本進(jìn)行初檢。對(duì)于HBsAg陽(yáng)性的標(biāo)本用金標(biāo)試紙條復(fù)測(cè)，篩選出金標(biāo)試紙條上質(zhì)控線明顯低于檢測(cè)線的標(biāo)本(見(jiàn)圖1)，再用純水倍比稀釋對(duì)應(yīng)標(biāo)本，選擇連續(xù)稀釋倍數(shù)中檢測(cè)線和質(zhì)控線相當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)作為最適稀釋倍數(shù)(見(jiàn)圖2)再在科美Chemclin 600儀器上檢測(cè)HBsAg。稀釋后的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)為最終樣本HBsAg結(jié)果。

圖1 金標(biāo)法篩選標(biāo)本稀釋前后對(duì)比圖

圖2 連續(xù)稀釋標(biāo)本金標(biāo)法測(cè)定結(jié)果

2 結(jié)果

240例HBsAg陽(yáng)性標(biāo)本中有10例出現(xiàn)假低值，占4. 17%。10例復(fù)檢標(biāo)本稀釋后結(jié)果及兩對(duì)半模式，見(jiàn)表1。

表1 10例篩選HBsAg陽(yáng)性標(biāo)本稀釋前后結(jié)果及兩對(duì)半模式(ng/ml)

3 討論

在10例陽(yáng)性標(biāo)本中出現(xiàn)的經(jīng)不同稀釋倍數(shù)后比稀釋前濃度明顯高出很多，差異很大，即出現(xiàn)假低值現(xiàn)象，分析原因包括: (1)標(biāo)本中的HBsAg含量很高時(shí)，標(biāo)本中的HBsAg分別與酶標(biāo)抗體和固相抗體形成免疫復(fù)合物，不形成“抗原－抗體－酶標(biāo)抗體”夾心復(fù)合物，即鉤狀效應(yīng)(Hook Effect)，導(dǎo)致出現(xiàn)假低值，嚴(yán)重時(shí)甚至可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果[1]。(2)加樣不足:標(biāo)本/酶標(biāo)試劑吸樣過(guò)程中吸到氣泡，導(dǎo)致只形成少量的夾心復(fù)合物。(3)固相抗體包被不足，或包被板打開(kāi)放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)失效，也無(wú)法形成足量的夾心復(fù)合物。

在出現(xiàn)假低值的這10例中，HBsAg與前S1抗原同時(shí)出現(xiàn)陽(yáng)性值，并且伴HBeAg或HBeAb其中一個(gè)指標(biāo)出現(xiàn)。其中兩例出現(xiàn)1，3，S1，其HBcAb的值接近臨界值，可能是急性感染期，HBcAg形成量少，HBcAb才產(chǎn)生。

在ELISA二步法檢測(cè)中，對(duì)于高濃度的HBsAg先與包被的固相抗體結(jié)合，經(jīng)洗滌后再與酶標(biāo)抗體結(jié)合而形成夾心復(fù)合物，從而有效的避免了鉤狀效應(yīng)。但二步法的溫育時(shí)間增加一倍，從而工作效率大大降低;同時(shí)因二步法靈敏度不及一步法，容易造成假陰性，低濃度的HBsAg漏檢。

由于膠體金試帶法設(shè)計(jì)特點(diǎn)，加樣區(qū)的HBsAg在前進(jìn)過(guò)程中先與金標(biāo)墊上的金標(biāo)單抗結(jié)合，形成金標(biāo)單抗－HBsAg結(jié)合物，在檢測(cè)區(qū)與HBsAg對(duì)應(yīng)的已知特異性抗體結(jié)合形成金標(biāo)單抗－HBsAg－特異性抗體復(fù)合物顯色，未結(jié)合多余的金標(biāo)單抗隨著液體前行至質(zhì)控區(qū)，與此區(qū)的金標(biāo)二抗結(jié)合形成金標(biāo)單抗－二抗結(jié)合物顯色。整個(gè)過(guò)程液體是單向緩慢層析，所以在檢測(cè)區(qū)抗原抗體結(jié)合會(huì)達(dá)到完全飽和狀態(tài)，色帶的深淺與待檢HBsAg含量成正比，沒(méi)有ELISA中的鉤狀效應(yīng)。

有資料顯示，GICA法(膠體金免疫試帶法)與ELISA在檢測(cè)HBsAg方面有較好的互補(bǔ)性[2]，和本實(shí)驗(yàn)有著高度一致。在選擇稀釋劑上，有報(bào)道生理鹽水在一步法可造成聚苯乙烯非特異性吸附，引起假性增高，推薦使用含0．05%的吐溫－20 (Tween－20)生理鹽水或含1%小牛血清白蛋白和0. 05%吐溫－20的磷酸鹽緩沖液(1% BSA－PBST)作為稀釋劑[3]，本次實(shí)驗(yàn)中采用純水作為稀釋劑，金標(biāo)法與稀釋后的高濃度HBsAg用科美Chem－clin 600檢測(cè)聯(lián)合應(yīng)用，能有效的消除鉤狀效應(yīng)，至于純水作為稀釋劑在科美Chemclin600上有沒(méi)有其他影響測(cè)定過(guò)程，有待后續(xù)研究。

[1]鄭懷亮，韓 松．臨床檢驗(yàn)指南[M]．北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1994:4-18．

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R512. 62

A

1008-7044(2015)04-0363-02

10．14126/j．cnki．1008－7044．2015．04．025

安徽省蚌埠市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，233000

王 科(1984－)，男，安徽蚌埠市人，檢驗(yàn)師，大學(xué)。

2015-01-06)

2015-01-30)