銀杏葉分散片中總黃酮醇苷的含量測定

齊惠珍周霞瑾田培虹

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(編號:20100419)

【摘要】目的建立HPLC法測定銀杏葉分散片中總黃酮醇苷含量的方法。方法色譜柱為Waters-pak C18 (5 μm，3.9 mm×150 mm)，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)，檢測波長360 nm，流速1.0 ml/min。結(jié)果異鼠李素、槲皮素、山奈素呈良好線性關(guān)系的范圍分別為 0.001～0.01 mg、 0.02～0.2、0.004～0.04/ml,平均回收率分別為99.76%，100.15%,99.40%，RSD為0.37%、0.72%、0.66%(n=9)。結(jié)論本方法準(zhǔn)確性好，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，結(jié)果可靠，可用于銀杏葉分散片中總黃酮醇苷的含量測定。

【關(guān)鍵詞】高效液相色譜法；銀杏葉分散片；總黃酮醇苷

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.050

【中圖分類號】R 927.2

收稿日期：(2015-05-09)

銀杏葉分散片是銀杏葉片劑型的一種，也是目前市場應(yīng)用比較普遍的銀杏葉劑型，其主要活性成分為總黃酮醇苷和萜類內(nèi)酯?？傸S酮醇苷中槲皮素、山奈素、異鼠李素三種黃酮苷元為其主要化學(xué)成分。作用于心臟、腦血管及外周血管系統(tǒng)，對治療冠心病、心絞痛、高血壓、支氣管哮喘等病癥有顯著效果[1]。本文參考《中華人民共和國藥典》(2010版)[2]及南葶藶子飲片中異鼠李素、槲皮素等成分的含量測定方法及相關(guān)文獻(xiàn)資料[3,4]，采用高效液相色譜法對銀杏葉分散片中總黃酮醇苷的含量進(jìn)行測定。

1材料與方法

1.1儀器與試劑主要實(shí)驗(yàn)儀器：2487紫外檢測器、美國生產(chǎn)Waters高效液相色譜儀、515液相色譜泵。采用市場銷售的銀杏葉分散片制劑三種，A：北京某制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20055421，批號131105 B：吉林某藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20060440，批號 141009；C:吉林某藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20060440，批號140304。異鼠李素(批號110860-200205，中國藥品生物制品檢定所)；槲皮素(批號10081-200406，中國藥品生物制品檢定所)；山奈素(批號110861-200303，中國藥品生物制品檢定所)；水采用的是二次純化水，甲醇采用色譜純、磷酸為分析純等試劑。

1.2色譜條件色譜柱：Waters Nova-pak C18 (5 μm，3.9 mm×150 mm)，流動相：甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)，流速1.0 ml/min，檢測波常長為：360 nm。

1.3溶液的制備

1.3.1制備供試品溶液:隨機(jī)選取20片銀杏葉分散片，研細(xì)，取相當(dāng)于總黃酮醇苷19.2 mg的粉末，精密稱定，置100 ml容量瓶中，加甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)的混合溶液25 ml，置水浴中加熱回流30 min，使其充分溶解，待溶液冷卻降至室溫后，向上述100 ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，震蕩搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾后所得濾液，即為銀杏葉分散片供試品試液。

1.3.2制備對照品溶液:精密稱取適量的異鼠李素、槲皮素、山奈素對照品，分別加入甲醇溶液制備成異鼠李素、槲皮素、山奈素的混合對照品溶液，濃度分別為0.01 mg/ml、0.20 mg/ml、0.04 mg/ml。

2方法與結(jié)果

2.1線性關(guān)系考察量取“1.3.2”項(xiàng)下異鼠李素、槲皮素、山奈素的對照品與甲醇溶液配制成如下濃度的混合溶液：對照品溶液1(含異鼠李素0.001 mg/ml、槲皮素 0.02 mg/ml、山奈素 0.004 mg/ml)，對照品溶液 2(含異鼠李素 0.002 mg/ml、槲皮素 0.04 mg/ml、山奈素0.008 mg/ml)，對照品溶液 3(含異鼠李素 0.004 mg/ml、槲皮素 0.08 mg/ml、山奈素 0.016 mg/ml)，對照品溶液 4(含異鼠李素 0.008 mg/ml、槲皮素 0.16 mg/ml、山奈素 0.032 mg/ml)，對照品溶液 5(含異鼠李素 0.01 mg/ml、槲皮素 0.20 mg/ml、山奈素 0.04 mg/ml)。 精密吸取并向液相色譜儀中分別注入對照品溶液20 μl，記錄峰面積， 以峰面積 A對進(jìn)樣量 C進(jìn)行線性回歸，分別得到異鼠李素、槲皮素、山奈素的線性回歸方程：異鼠李素 A=24 179 214C-225 761(r=0.9997)；槲皮素 A=31 247 671C-15 557(r=0.9996)；山奈素 A=30 420 567C + 614 691 (r=0.9998)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異鼠李素、槲皮素、山奈素分別在0.001～0.01、0.02～0.2、0.004～0.04 mg/ml 濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。見圖1。

采用陳杭君等[10]的方法，略有修改，具體操作如下。取2 g樣品，加入5 g水，加入20 mL 70% pH 3.0的酸性乙醇溶液，在40 ℃下水浴2 h，提取至提取液無色，過濾后備用。采用pH差示法測其花色苷的含量，取2 mL提取液于25 mL比色管中，用pH 1.0緩沖液（0.2 mol/L KCl-0.2 mol/L HCl）稀釋至10 mL刻度線處，另取2 mL提取液于25 mL比色管中，用pH 4.5緩沖液（1 mol/L NaAC-1 mol/L HCl-H2O）稀釋至10 mL刻度線處，在510 nm處測量吸光度值。根據(jù)下式計(jì)算總花色苷含量（g/L）。

圖1　HPLC色譜圖(I=異鼠李素，Q=槲皮素，K=山奈素)

(1)混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖; (2)分散片樣品色譜圖

2.2精密度試驗(yàn)精密吸取10 μl對照品混合溶液，按“1.2”項(xiàng)下所列的色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次，并分別記錄每次所得的峰面積。測得異鼠李素峰面積的RSD為1.6%、槲皮素峰面積的RSD為1.5%、山奈素峰面積的RSD為1.3%，表明具有較好的精密度。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)取銀杏葉分散片(批號140304)供試品溶液，按“1.2”項(xiàng)下所述的色譜條件，于(0、1、2、4、8、12、24 h)分別進(jìn)樣10 μl，記錄各時(shí)間點(diǎn)的峰面積，結(jié)果異鼠李素峰面積RSD為1.2%、槲皮素峰面積RSD為1.0%、山奈素的峰面積RSD為0.8%，結(jié)果表明，在室溫條件下，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)取相同批號的銀杏葉分散片(批號140304)各6份，按“1.3.1”項(xiàng)下方法制備所需供試品溶液，進(jìn)樣量為10 μl，分別測得峰面積，再按照公式，總黃酮醇苷含量=(異鼠李素含量+槲皮素含量+山奈素含量)×2.51計(jì)算，得出異鼠李素、槲皮素、山奈素的含量分別為0.68、4.45、2.85 mg/粒，總黃酮醇苷平均含量為20.03 mg/粒(RSD=1.5%)。結(jié)果表明，本法具有較好的重復(fù)性。

2.5加樣回收率試驗(yàn)精密稱取相同批號的銀杏葉分散片(批號140304)適量，分別精密加入對照品，按照供試品溶液制備項(xiàng)所述的操作進(jìn)行測定。測得槲皮素、山奈素、異鼠李素的平均回收率分別為99.76%、100.15%和99.40%，RSD分別為0.37%、0.72%、0.66%。見表1。

2.6樣品含量測定取3個(gè)生產(chǎn)批號的銀杏葉分散片，按“1.3.1”項(xiàng)所述方法，分別制成10 μl的銀杏葉分散片供試品溶液及“1.3.2”項(xiàng)下的混合對照品溶液，注入色譜儀，按“1.2”項(xiàng)下所列的色譜條件依次測定，并記錄每次的峰面積。按色譜外標(biāo)法計(jì)算出樣品中異鼠李素、槲皮素、山奈素的含量，從而得到總黃酮醇苷的含量。見表2。

3討論

3.1檢測波長的選擇在實(shí)驗(yàn)過程中，分別采用340 nm、360 nm、380 nm波長進(jìn)行測試，其中360 nm

表1　回收率試驗(yàn)結(jié)果　n=9

表2　樣品含量測定結(jié)果　n=3，%

有最大吸收峰，因此，采用360 nm為檢測波長。

3.2流動相的選擇:為了使所檢測的色譜峰分離度好，出峰時(shí)間合理，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)查閱文獻(xiàn)后[5,6]，分別試用甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)及甲醇-水(50∶50)，乙腈-0.4%磷酸溶液作為流動相進(jìn)行考察。當(dāng)流動相甲醇-0.4%磷酸溶液配比為(50∶50)時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)主要成分與雜質(zhì)完全分離的目的，得到分離效果較好的色譜峰。而甲醇-水和乙腈-0.4%磷酸溶液對峰形及分離度影響不大，故選擇甲醇-0.4%磷酸溶液(50∶50)作流動相系統(tǒng)。

3.3在提取時(shí)，通過對甲醇超聲提取、甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)的混合溶液水浴加熱回流法、鹽酸加熱水解法這三種不同的提取方法進(jìn)行對比分析，試驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)的混合溶液水浴加熱回流法，可使黃酮醇苷類成分較完全的水解，提取效果較好。

3.4考察了甲醇-10%鹽酸溶液、甲醇-25%鹽酸溶液、甲醇-30%鹽酸溶液等不同酸強(qiáng)度、不同溫度下及不同冷卻時(shí)間(10 min、20 min、30 min)對測定結(jié)果的影響。結(jié)果甲醇-25%鹽酸，水解溫度為95℃，可使黃酮醇苷完全水解，速冷30 min可使反應(yīng)停止。

本研究的實(shí)驗(yàn)方法，簡便快捷，有較好的穩(wěn)定性，重現(xiàn)性好，可作為銀杏葉分散片中測定總黃酮醇苷含量較為可靠的方法。

參考文獻(xiàn)

1潘洪平.銀杏葉制劑藥理作用和臨床應(yīng)用研究進(jìn)展.中國中藥雜志, 2005, 30: 93.

2國家藥典委員會主編.中華人民共和國藥典.一部. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010.1079.

3沈潔,任世禾.復(fù)方銀杏葉膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究.上海中醫(yī)藥雜志, 2007, 41: 79.

4馬梅芳,呂文海.HPLC 法同時(shí)測定南葶藶子飲片中槲皮素、山奈素及異鼠李素的含量.中國藥事,2009,23:65-67.

5姜帆，楊星剛，郭迎新,等. 銀杏葉制劑溶出度中槲皮素、山奈素與異鼠李素的HPLC測定方法研究. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,30:691-695.

6齊惠珍，周霞瑾，王明霞. 3種不同劑型銀杏葉制劑中總黃酮醇苷的溶出度考察.華西藥學(xué)雜志，2014,29：630-632.

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