作者單位：100039北京，武警總醫(yī)院消化內(nèi)科

息肉標(biāo)本預(yù)處理方法對(duì)高分辨率顯微內(nèi)鏡成像效果的影響

談濤，屈亞威，劉海峰

【摘要】目的比較結(jié)腸息肉標(biāo)本不同預(yù)處理方法對(duì)高分辨率顯微內(nèi)鏡成像效果的影響。方法選擇90例離體結(jié)腸息肉標(biāo)本，隨機(jī)分為3組，分別使用生理鹽水(A組)、生理鹽水+去黏液劑(B組)、生理鹽水+去黏液劑+高滲糖溶液(C組)沖洗，預(yù)處理結(jié)腸息肉標(biāo)本后分別進(jìn)行高分辨率顯微內(nèi)鏡成像觀察，然后行病理學(xué)檢查，比較三組圖片質(zhì)量，并與病理結(jié)果對(duì)照，分析診斷的準(zhǔn)確率。結(jié)果每組息肉標(biāo)本獲得高分辨率顯微內(nèi)鏡圖片900張，A組優(yōu)質(zhì)圖片317張，優(yōu)質(zhì)率為35.2%，B組優(yōu)質(zhì)圖片493張，優(yōu)質(zhì)率為54.8%，C組優(yōu)質(zhì)圖片564張，優(yōu)質(zhì)率為62.7%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與病理檢查對(duì)比，A組同時(shí)診斷為腺瘤性息肉9例、非腺瘤性息肉8例，診斷準(zhǔn)確率為56.7%；B組同時(shí)診斷為腺瘤性息肉13例、非腺瘤性息肉7例，診斷準(zhǔn)確率為66.7%；C組同時(shí)診斷為腺瘤性息肉12例、非腺瘤性息肉15例，診斷準(zhǔn)確率為90.0%，高分辨率顯微內(nèi)鏡診斷結(jié)腸息肉總體準(zhǔn)確率為71.1%，C組與A組相比、C組與B組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論使用生理鹽水+去黏液劑+高滲糖溶液處理標(biāo)本可以提高高分辨率顯微內(nèi)鏡診斷準(zhǔn)確性。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸息肉；高分辨率顯微內(nèi)鏡；去黏液劑；高滲糖；診斷

通訊作者：劉海峰，E-mail：haifengliu333@163.com

作者簡介：田南，碩士研究生，E-mail：963422126@qq.com

【中國圖書分類號(hào)】R730.49

Affect of different pretreatment methods of polyp specimens on high-resolution microendoscopic imaging

TAN Tao, QU Yawei, and LIU Haifeng. Department of Gastroenterology,General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces,Beijing 100039, China

Abstract【】ObjectiveTo verify the effect of high-resolution microendoscopic imaging and to compare the effects of different pretreatment methods for colon polyps specimens in high-resolution microendoscopic imaging and the accuracy of the diagnosis of disease. MethodsIn vitro specimens from 90 patients with colon polyps were randomly divided into three groups: using saline (group A), saline plus mucus removing agent (group B), saline, and mucus removing agent plus hypertonic glucose solution (group C) to wash and high-resolution microscopic imaging was made for pretreated specimens of colon polyps and then for pathological examination.The picture quality of the three groups was analyzed. ResultsThe high-resolution microscopic images are 900 for specimens in each polyp, high-quality images in group A were 317 and high quality rate was 35.2%; high-quality images in group B were 493 and high quality rate was 54.8%; and high-quality images in group C were 564 and high quality rate was 62.7%, the difference was statistically significant (P<0.05).Compared with the pathological examination, group A showed simultaneous diagnosis of adenomatous polyps in 9 cases, 8 cases of non-adenomatous polyps, with diagnostic accuracy of 56.7%;group B showed simultaneous diagnosis of adenomatous polyps in 13 cases, non-adenomatous polyps in 7 cases, with diagnostic accuracy of 66.7%; and group C showed simultaneous diagnosis of adenomatous polyps in 12 cases, non-adenomatous polyps in 15 cases, with diagnostic accuracy of 90.0%. The overall accuracy of high-resolution microendoscopy in diagnosis of colon polyps was 71.1%. In Group C, compared with group A, and compared with group B. The difference was statistically significant (P<0.05). ConclusionsHigh-resolution microendoscopy has good imaging results for polyp specimens after pretreatment. It can improve the picture quality and diagnostic accuracy before imaging using saline combined with mucus removing agent and hypertonic glucose solution.

【Key words】colon polyps; high resolution microendoscopy; mucus removing agent; hypertonic glucose; diagnosis

高分辨率顯微內(nèi)鏡(high resolution microendoscopy，HRME)是一種新型的成像技術(shù)，早期主要用于細(xì)胞成像研究[1]，近年來有學(xué)者開始嘗試應(yīng)用于臨床研究[2-4]。借鑒國外學(xué)者的研究經(jīng)驗(yàn)，筆者研制出一套HRME成像系統(tǒng)，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))證明該成像系統(tǒng)對(duì)胃腸道黏膜具有較好的成像效果。為了進(jìn)一步提高圖像質(zhì)量，本研究選擇離體結(jié)腸息肉為研究對(duì)象，比較不同預(yù)處理方法對(duì)結(jié)腸息肉標(biāo)本高分辨率顯微內(nèi)鏡成像效果的影響為優(yōu)化預(yù)處理流程提供依據(jù)。

1　對(duì)象和方法

1.1對(duì)象2014-07至2014-10在我院消化內(nèi)鏡中心行電子結(jié)腸鏡檢查診斷為結(jié)腸息肉的90例，其中男62例，女28例(男女比例為2.2∶1)，年齡為21～83歲，平均(48.4±5.3)歲。對(duì)經(jīng)電凝切除、內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)(endoscopic mucosal resection，EMR)和內(nèi)鏡下黏膜剝離術(shù)(endoscopic submucosal dissection，ESD)，術(shù)后90枚離體息肉標(biāo)本進(jìn)行HRME成像研究，息肉直徑0.6～4.2 cm。

1.2方法

1.2.1成像設(shè)備使用自行研制的HRME成像系統(tǒng)，包括1根含30 000像素、長1.8 m的光纖、10×顯微鏡鏡頭、500 nm二向色鏡、濾光片、三維組合平移臺(tái)、科學(xué)級(jí)低溫制冷CCD相機(jī)和計(jì)算機(jī)圖像處理軟件，成像過程中圖像以17幀/s的速度傳輸至計(jì)算機(jī)(圖1)。

圖1　HRME結(jié)構(gòu)原理

1.2.2試劑0.01%原黃素鹽酸鹽(美國Sigma公司)、0.9%生理鹽水(辰欣藥業(yè)股份有限公司)、50%葡萄糖溶液(華潤雙鶴藥業(yè)股份有限公司)、鏈霉蛋白酶顆粒(北京泰德制藥股份有限公司)、碳酸氫鈉(北京奇祥宏業(yè)商貿(mào)有限公司)。

1.2.3成像方法

1.2.3.1標(biāo)本預(yù)處理術(shù)前充分進(jìn)行腸道準(zhǔn)備，對(duì)于腸道準(zhǔn)備差的患者，術(shù)中盡可能沖盡息肉表面的糞渣及殘留物。對(duì)術(shù)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)腸息肉，經(jīng)電凝切除、EMR和ESD術(shù)后，標(biāo)本用于成像研究。將息肉標(biāo)本隨機(jī)分為A、B、C三組，A組標(biāo)本用0.9%生理鹽水緩慢沖洗1 min，沖洗后干棉球擦干，備用。B組標(biāo)本先用0.9%生理鹽水緩慢沖洗1 min后，再用配制好的鏈蛋白酶和碳酸氫鈉混合溶液沖洗1 min；再次使用0.9%生理鹽水沖洗，干棉球擦干，備用。C組標(biāo)本在依次使用生理鹽水和去黏液劑沖洗后，再用50%葡萄糖溶液沖洗1 min，最后用0.9%生理鹽水沖去表面殘留溶液，干棉球擦干，備用。

1.2.3.2成像系統(tǒng)搭建搭建HRME成像系統(tǒng)，啟動(dòng)計(jì)算機(jī)成像軟件，調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)視野中能清晰分辨出每個(gè)像元時(shí)為最佳成像狀態(tài)。

1.2.3.3成像過程對(duì)預(yù)處理后的標(biāo)本分別局部噴灑0.01%原黃素鹽酸鹽1～2 ml，染色劑在組織表面大約停留30 s后緩沖鹽沖洗表面殘留染料，干棉球輕輕擦干組織表面殘留液體。將光纖頭端以不同角度觀察組織表面，標(biāo)記觀察部位，每個(gè)標(biāo)本留取30張清晰的圖片用于分析。檢查結(jié)束后組織行病理檢查。

1.2.3.4圖片質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)參照Peter等[5]的方法，HRME圖像中細(xì)胞核顯像高于50%的圖片定為優(yōu)，而細(xì)胞核顯像低于50%的圖片定為差，對(duì)所得圖片進(jìn)行分析。

整個(gè)HRME成像過程應(yīng)在15 min內(nèi)完成，圖片解讀由兩名經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)的醫(yī)師共同完成，圖片分析結(jié)果與病理結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，整個(gè)過程在雙盲模式下完成。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用四格表方式，分別計(jì)算A、B、C三組圖片的優(yōu)質(zhì)率以及三組HRME診斷結(jié)腸息肉與病理學(xué)診斷的相比較的準(zhǔn)確性，采用χ2檢驗(yàn)比較三組圖片優(yōu)質(zhì)率和診斷準(zhǔn)確率，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1HRME圖片質(zhì)量分析C組與A組相比、C組與B組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1　HRME圖片質(zhì)量分析

注：與A、B組優(yōu)質(zhì)率比較，①P<0.05

2.2HRME診斷結(jié)果根據(jù)細(xì)胞核的大小、形態(tài)、排列方式、腺體結(jié)構(gòu)，初步制定了HRME診斷結(jié)腸息肉的標(biāo)準(zhǔn)，非腺瘤性息肉診斷標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核大小一致、形態(tài)規(guī)則，排列有序，圓形或橢圓形的腺體結(jié)構(gòu)(圖2)。腺瘤性息肉診斷標(biāo)準(zhǔn)：腺體增大，可見較多的線性隱窩，開口擴(kuò)張，腺體呈管狀或指狀結(jié)構(gòu)，偶爾可見絨毛結(jié)構(gòu)(圖3)。C組與A組相比、C組與B組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表2　HRME診斷標(biāo)準(zhǔn)與病理學(xué)診斷結(jié)果比較

注：與A、B組準(zhǔn)確率比較，①P<0.05

圖2非腺瘤性息肉(HE，×40)

A.白光內(nèi)鏡；B.HRME；C.病理

圖3　腺瘤性息肉(HE，×40)

3　討　　論

HRME是基于高分辨率光纖和分子成像技術(shù)開發(fā)出的一種新的成像方法，能夠?qū)M織進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平的組織成像[6-8]。近年有研究者利用高分辨率顯微內(nèi)鏡成像技術(shù)進(jìn)行活體組織病理學(xué)成像，證實(shí)了HRME成像的可行性[2-4]。筆者使用自行研制的HRME成像系統(tǒng)對(duì)離體結(jié)腸息肉標(biāo)本進(jìn)行了HRME成像的初步研究，發(fā)現(xiàn)該成像系統(tǒng)對(duì)離體結(jié)腸息肉具有很好的成像效果和診斷準(zhǔn)確率，與組織病理學(xué)相比較，三組診斷準(zhǔn)確率分別為56.7%、73.3%和86.7%，表明HRME對(duì)病變的的診斷具有較高的準(zhǔn)確性，而改善成像前的標(biāo)本處理方法可以提高診斷的準(zhǔn)確率。與組織病理學(xué)相比，HRME具有耗時(shí)短、花費(fèi)少、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，具有重要臨床意義[9]。

如何獲得高質(zhì)量的圖片成為HRME成像技術(shù)的一大難題。成像前標(biāo)本的預(yù)處理是決定成像效果的重要因素。對(duì)于消化道組織標(biāo)本而言，其表面主要附著物為唾液、黏液、糞液及其他雜質(zhì)成分。唾液和黏液主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)、H+和水分等[10]。對(duì)于標(biāo)本的清潔主要依靠沖洗，以前僅使用生理鹽水沖洗，沖洗效果不盡如人意。本研究通過對(duì)組織表面附著物化學(xué)成分的研究，改進(jìn)了沖洗方法，可以分為四步：(1)用生理鹽水沖洗初洗，去除表面的殘留物；(2)用鏈蛋白酶(或糜蛋白酶)和碳酸氫鈉混合溶液沖洗，去除組織表面的蛋白質(zhì)和H+成分；(3)用高滲糖溶液沖洗；(4)用生理鹽水沖洗，去除表面殘留的沖洗液。通過這種沖洗方法對(duì)組織進(jìn)行預(yù)處理，組織表面的清潔度得到改善，成像效果明顯提高。本研究比較了三種沖洗方法對(duì)成像圖片的影響，A組圖片優(yōu)質(zhì)率為35.2%，B組圖片優(yōu)質(zhì)率為54.8%，C組圖片優(yōu)質(zhì)率為62.7%，表明通過該種沖洗方法可以獲得最好的成像效果。

蛋白酶和碳酸氫鈉沖洗的作用原理主要是通過蛋白酶使蛋白水解以及碳酸氫鈉與酸的中和作用[11]。根據(jù)不同組織表面的不同蛋白質(zhì)成分可以選擇相應(yīng)的特異性蛋白酶，會(huì)得到更好的效果。高滲溶液沖洗的原理主要是根據(jù)高滲溶液作用于細(xì)胞表面可以使細(xì)胞內(nèi)水分由于濃度差的作用而流入細(xì)胞外，從而使細(xì)胞處于相對(duì)脫水狀態(tài)[12]，表面噴灑熒光對(duì)比劑更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞核的染色效果更好。但實(shí)驗(yàn)過程中要把握好高滲溶液的濃度和時(shí)間，防止細(xì)胞長時(shí)間脫水狀態(tài)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，以至于細(xì)胞核不能著色。研究中主要應(yīng)用高滲糖溶液，根據(jù)其原理也可以使用高滲鹽、高濃度乙醇或其他對(duì)細(xì)胞無毒害作用的高滲溶液。

總之，成像前標(biāo)本的清洗是成像成功的關(guān)鍵，筆者嘗試了很多方法，成像效果得到了明顯改善，但還需要繼續(xù)探索，希望能有更好的預(yù)處理方法。

HRME作為一種新型的成像方法展現(xiàn)了很多優(yōu)點(diǎn)，尤其是與傳統(tǒng)的內(nèi)窺鏡相比更是具有即時(shí)組織病理學(xué)的優(yōu)勢，因此也受到越來越多的關(guān)注[13]。但HRME的成像方法還沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，筆者通過研究總結(jié)了一些經(jīng)驗(yàn)，希望能對(duì)更多的研究提高幫助。然而，更好的成像方法還需要我們不斷的探索和實(shí)踐。

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(2015-01-11收稿2015-03-11修回)

(責(zé)任編輯梁秋野)