段云燕 成映霞 王強 李蘭珍 王慶勝 鄭世鐸 魯鵬程 雷作漢 劉雪松 劉臻華

摘要：目的 觀察香砂六君子湯對脾胃虛弱型萎縮性胃炎（CAG）大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性、胃黏膜組織缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表達的影響，探討該復方防治CAG的作用機制。方法 受試大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組和造模組，采用綜合法復制脾胃虛弱型CAG動物模型，成模后將模型大鼠分為模型組、陽性對照組和香砂六君子湯高、中、低劑量組。空白組和模型組大鼠每日給予10 mL/kg蒸餾水灌胃，香砂六君子湯大、中、小劑量組每日分別給予24、12、6 g/kg香砂六君子湯藥液灌胃，陽性對照組每日給予0.30 g/kg維霉素藥劑灌胃，連續(xù)給藥120 d，檢測各組大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性，分別采用實時熒光定量PCR和免疫組化法檢測胃黏膜組織HIF-1α基因及蛋白表達。結果 與空白組比較，模型組大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性顯著降低（P<0.01），HIF-1α基因和蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，香砂六君子湯各組大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性升高，HIF-1α基因和蛋白表達水平降低，且以香砂六君子湯高劑量組作用顯著（P<0.05）。結論 香砂六君子湯具有改善脾胃虛弱型CAG大鼠胃排空功能、促進胃蛋白酶活性、下調(diào)缺氧環(huán)境中HIF-1α基因和蛋白表達的作用。

關鍵詞：胃排空功能；胃蛋白酶；缺氧誘導因子-1α；萎縮性胃炎；香砂六君子湯；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.011

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）01-0047-05

Effects of Xiangsha Liujunzi Decoction on Gastric Emptying Function， Pepsin Activity and Expression of HIF-1α in Chronic Atrophic Gastritis of Rats with Deficiency Spleen and Stomach DUAN Yun-yan1，2， CHENG Ying-xia1，2， WANG Qiang1， LI Lan-zhen2， WANG Qing-sheng1， ZHENG Shi-duo2， LU Peng-cheng2， LEI Zuo-han3， LIU Xue-song1， LIU Zhen-hua1 （1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730020， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Herbs and Prescription Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730020， China； 3. Gansu Chinese Medicine Hospital， Lanzhou 730020， China）

Abstract： Objective To study effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on gastric emptying function， pepsin activity and expression of HIF-1α gene and protein of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） of rats with deficiency of spleen and stomach. Methods Rats were randomly divided into normal group and model group. The models of CAG rats with deficiency of spleen and stomach type were induced by synthetic methods. After the modeling， models rats were divided into model group， positive control group and XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups. Normal group and model group were given 10 mL/kg distilled water every day for gavage； XSLJZ high-， medium-， and low-dose groups were given 24， 12， and 6 g/kg XSLJZ Decoction for gavage； positive control

group was given 0.30 g/kg Vatacoenayme for gavage， for successive 120 d. Gastric emptying function and pepsin activity were detected， and HIF-1α gene and protein expression in gastric mucosa were detected by RT-qPCR and IHC. Results Compared with the normal group， the gastric emptying function and pepsin activity in the model group were much lower （P<0.01）； expressions of HIF-1α gene and protein in gastric tissues was much higher （P<0.01）. Compared with model group， XSLJZ could increase the gastric emptying function and pepsin activity significantly （P<0.05）， and decrease expressions of HIF-1α gene and protein （P<0.05）. Conclusion XSLJZ has functions of improving the gastric emptying function， promoting pepsin activity， and reducing expressions of HIF-1α gene and protein.

Key words： gastric emptying function； pepsin； HIF-1α； atrophic gastritis； Xiangsha Liujunzi Decoction； rats

慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）作為消化系統(tǒng)常見病，尤其在CAG伴有腸上皮化生和異常增生時，易引起繼發(fā)性胃癌，嚴重威脅生命質(zhì)量。就其臨床病癥特點而言，中醫(yī)認為CAG多以脾胃虛弱、氣機或氣血失調(diào)為主要病機，故治療多以健脾益氣、理氣和胃為大法。香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》。臨床應用顯示，香砂六君子湯及其加減方治療CAG療效顯著[1-2]。本研究通過觀察香砂六君子湯對脾胃虛弱型CAG大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性及胃竇黏膜缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）基因和蛋白表達的影響，探討該復方防治CAG的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

2月齡SPF級健康Wistar大鼠54只，體質(zhì)量（160±10）g，甘肅中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗中心，動物合格證號SCXK（甘）2011-0001-0001010。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級實驗室，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)，濕度45%～55%，室溫（23±2）℃，喂養(yǎng)滅菌標準飼料和消毒純凈水，自由飲水進食。本實驗動物處理相關程序遵守中國國家健康與醫(yī)學研究委員會動物道德準則，并得到甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會的批準。

1.2 藥物

香砂六君子湯以人參、白術、茯苓、陳皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制（飲片均購自蘭州復興厚中藥材有限責任公司，并經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院中藥生藥學教研室楊扶德教授鑒定合格），第1次加10倍量蒸餾水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，濾出藥液加熱濃縮至每1 mL藥液含原藥材2 g，冷卻后置4 ℃冰箱備用，使用時稀釋至所需濃度；維酶素片，新鄉(xiāng)恒久遠藥業(yè)有限公司，0.2 g/片，批號20140108。

1.3 主要試劑與儀器

脫氧膽酸鈉，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，批號SLBC0243V；吲哚美辛，上海信誼黃河制藥有限公司，批號120702；氨水，白銀良友化學試劑有限公司，批號120102；乙醇，天津市富宇精細化工有限公司，批號120100107；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒（批號20140813）、胃蛋白酶測定試劑盒（批號20140821），南京建成生物科技有限公司；β-actin、HIF-1α引物，寶生物工程（大連）有限公司；Trizol試劑（批號AK7208-1）、反轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR試劑盒（批號0000036802），Promega Corporation；辣根酶標記山羊抗兔IgG（H+L），批號ZB-2301，北京中杉金橋生物科技有限公司；Anti-HIF-1α antibody（批號B3301），美國ImmunoWay公司。DF110型電子分析天平，江蘇常熟衡器工業(yè)公司；XYJ80-2離心機，廣東塘廈駿越機電設備廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴箱，江蘇省金壇市友聯(lián)儀器研究所；Benchmark Plus酶聯(lián)免疫檢測儀、BIOMATE 3S核酸蛋白測定儀、S1000TM逆轉(zhuǎn)錄儀、Chemi DOC XRS凝膠成像分析系統(tǒng)、CFX96TM Optics Module PCR儀，美國BIO-RAD公司；BX51/BX52型Olympus系統(tǒng)顯微鏡，日本Olympus公司。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

除空白組8只大鼠正常飼養(yǎng)不予造模外，其余46只大鼠參照文獻[3]方法造模。造模組采用復合慢性損傷因素聯(lián)合作用：①60%乙醇，每3 d空腹灌胃1次（前1 d晚上撤除飼料），每次8 mL/kg；②20 mmol/L脫氧膽酸鈉灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；③每日配制0.1%氨水作為大鼠日常飲用水自由飲用，并記錄每日飲用量；④0.05%吲哚美辛灌胃，每日1次，每次8 mL/kg；⑤采用饑飽失常喂養(yǎng)法：2 d足量喂養(yǎng)，1 d禁食。連續(xù)造模40周。待綜合法造模30周時，每隔1周隨機抽檢大鼠，取胃黏膜組織做病理檢查并判定胃黏膜萎縮病理變化，評價CAG模型大鼠胃黏膜萎縮病理形成后開始治療。將CAG大鼠按體質(zhì)量編號，采用隨機數(shù)字表法分為模型組、陽性對照組和香砂六君子湯高、中、低劑量組，每組8只。

2.2 給藥

香砂六君子湯高、中、低劑量組每日分別給予24、12、6 g/kg香砂六君子湯藥劑灌胃（相當于60 kg成人劑量的12、6、3倍）；對照組每日給予0.30 g/kg維酶素藥劑灌胃（相當于60 kg成人劑量的6倍），等效劑量按人與動物系數(shù)折算[4]。連續(xù)給藥120 d。每日給藥體積為10 mL/kg。空白組和模型組給予等量蒸餾水灌胃。

2.3 標本采集與檢測

胃排空率實驗參照文獻[5]方法，于末次給藥后禁食不禁水24 h后，分別隨機抽取各組大鼠8只，給予半固體營養(yǎng)糊2 mL，30 min后用烏拉坦1 g/kg麻醉采血后，迅速打開腹腔，結扎幽門和賁門后取出胃，清除胃表面的血漬，第1次稱重（胃總重），后剪開胃體，洗去胃內(nèi)容物，用濾紙吸干水分第2次稱重（胃凈重），計算胃排空率[1-（胃總重-胃凈重）÷所給糊重×100%]。胃黏膜組織勻漿制備：麻醉處死后低溫條件下快速剖取胃黏膜組織，以冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重后用眼科小剪刀盡快剪碎，置于勻漿器中，用組織重9倍生理鹽水勻漿，3500 r/min離心10 min，取上清液，置4 ℃冰箱保存，待測胃組織蛋白酶活性。

2.4 胃黏膜組織缺氧誘導因子-1α基因表達檢測

取適量胃竇組織，用Trizol法抽提總RNA：將保存于-80 ℃冷凍冰箱中各組大鼠胃竇組織稱取50 mg組織塊置于研缽中，加入1 mL Trizol，研磨均勻，于冰上孵育 5 min 后，4 ℃、12 000×g離心5 min；移入離心管中，冰上孵育5 min后加0.2 mL氯仿，震蕩后4 ℃、12 000×g離心15 min，取上清液移至新離心管，加0.5 mL異丙醇，震蕩，冰上孵育10 min后，4 ℃、12 000×g離心 10 min，棄上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入 1 mL 75%乙醇，震蕩后4 ℃、8000×g離心10 min，棄上清液后室溫下干燥，加入 50 μL DEPC 處理水溶解RNA。核酸定量分析儀測定其OD260/OD280均在1.8～2.0之間，經(jīng)總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測符合純度要求，可用于后續(xù)PCR。

反轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA：在0.5 mL去酶管中加入總RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μL、Random Primer 1 μL，加Nuclease-Free Water至10 μL；70 ℃變性5 min，然后冰上放置5 min以上；加入反轉(zhuǎn)錄GoScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μL，MgCl2（25 mmol/L）2 μL，PCR Nucleotide Mix（10 mmol/L）1 μL，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μL，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μL，Nuclease-Free Water至10 μL，總體積為20 μL?；靹蚺渲频姆磻旌衔铮虝弘x心后在25 ℃溫浴5 min，42 ℃反應60 min，再70 ℃、15 min滅活處理，所得單鏈cDNA放置于-20 ℃?zhèn)溆?。從NCBI中查詢目標基因ID及序列，由TAKARA公司寶生物工程（大連）有限公司設計和合成目標基因引物。HIF-1α引物序列為：上游5'-CCAGATTCA AGATCAGCCAGCA-3'，下游5'-GCT GTCCACATC AAAGCAGTACTCA-3'，擴增片段長度為100 bp；β-actin引物序列為：上游5'-GGAGATTACTGCCCT GGCTCCTA-3'，下游5'-GACTCATCG TACTCCTGC TTGCTG-3'，擴增片段長度為150 bp。實時熒光定量PCR以β-actin作為內(nèi)參基因，相同模板相同基因設3復孔、6次平行實驗，得到各擴增反應的Ct值。反應體系據(jù)GoTaq 2-Step RT-qPCR試劑盒說明書配制。反應參數(shù)：預變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循環(huán)40 次，終末延伸65 ℃、5 s。連續(xù)檢測熒光并記錄擴增曲線，采用樣點擬合法分析結果得到目的基因和β-actin的Ct值。測Ct值并分析融解曲線，以β-actin為內(nèi)參，用比較Ct值法計算相對表達量：ΔΔCt=（測試組目的基因Ct值-測試組內(nèi)參基因Ct值）-（對照組目的基因Ct值-對照組內(nèi)參基因Ct值），相對表達量用2-ΔΔCt表示。

2.5 胃黏膜組織缺氧誘導因子-1α蛋白表達檢測

胃竇組織塊浸于4%多聚甲醛中固定后，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，做連續(xù)切片，片厚4 μm。取各大鼠等部位切片3張，經(jīng)二甲苯二級脫蠟各5 min，梯度酒精脫水，高壓熱修復后滴加1∶100比例稀釋的兔抗大鼠HIF-1α一抗4 ℃過夜，次晨取出置常溫，PBS沖洗后，滴加二抗，37 ℃孵育l h，DAB顯色，水沖洗后蘇木素復染、脫水、透明、中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，胞漿黃染；空白組采用0.01 mol/L PBS代替一抗同時進行免疫組化染色，應用BI-2000多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)對免疫組化切片進行圖像分析，每個部位取6個視野，分別測量同一視野中反映免疫反應物陽性強度的平均光密度、分布密度數(shù)值，并以平均數(shù)進行統(tǒng)計學分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間樣本均數(shù)比較采用F檢驗，在F檢驗有統(tǒng)計學意義時，再用q檢驗進行兩兩比較。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 各組大鼠一般生存情況

空白組大鼠始終表現(xiàn)為反應靈敏，活動及攝食量正常，被毛濃密柔順而有光澤，糞便呈棕褐色顆粒狀。CAG模型50%大鼠第6周即開始出現(xiàn)倦臥、被毛稀疏干枯、攝食量減少；第8周后出現(xiàn)少食怠動、消瘦，對外界反應遲鈍的病理表現(xiàn)，隨著造模時間延長，大鼠生存能力明顯下降，表現(xiàn)為怠動少食、消瘦弓背、毛發(fā)枯槁疏散，75%大鼠攝食量明顯減少，容易出現(xiàn)瞇眼蜷縮、反應遲鈍，平均每日體質(zhì)量增加量和攝食量明顯下降。經(jīng)藥物干預后，香砂六君子湯各劑量組和陽性對照組大鼠治療第10周開始上述癥狀逐漸減輕或消失，表現(xiàn)為反應較為靈敏，被毛疏散但有光澤，活動及飲食量正常，平均每日體質(zhì)量增加量和攝食量恢復接近正常，尤其以香砂六君子湯高劑量組大鼠一般生存情況恢復正常明顯。

4.2 香砂六君子湯對大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，香砂六君子湯高、中、低劑量組和陽性對照組均能升高大鼠胃排空率和胃蛋白酶活性，且以香砂六君子湯高劑量組和陽性對照組作用顯著（P<0.05）。結果見表1。

4.3 香砂六君子湯對大鼠胃黏膜組織缺氧誘導因子-1α基因表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織HIF-1α基因表達水平顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，香砂六君子湯高、中、低劑量組和陽性對照組均能降低大鼠胃黏膜組織HIF-1α基因表達水平，且以香砂六君子湯高劑量組和陽性對照組作用顯著（P<0.01）。結果見表2。

4.4 香砂六君子湯對大鼠胃黏膜組織缺氧誘導因子-1α蛋白表達的影響

通過陽性免疫產(chǎn)物表達數(shù)據(jù)分析，平均光密度和分布密度與HIF-1α蛋白的陽性表達成正比。與空白組比較，模型組大鼠胃黏膜組織陽性免疫產(chǎn)物平均光密度和分布密度計數(shù)水平顯著升高（P<0.01），提示HIF-1α蛋白表達水平升高；與模型組比較，香砂六君子湯高、中、低劑量組可降低胃黏膜組織陽性免疫產(chǎn)物平均光密度和分布密度計數(shù)水平，且以香砂六君子湯高劑量組和陽性對照組作用顯著（P<0.05），提示HIF-1α蛋白表達水平降低。結果見表3。

5 討論

根據(jù)CAG的脘腹脹痛、噯氣納呆、運化遲滯、大便或溏或結、面色萎黃、形體逐漸消瘦等臨床表現(xiàn)，可將其歸屬于中醫(yī)學“痞滿”“胃痞”等范疇，CAG主要病機在于脾胃虛弱（或脾胃虛寒），中焦氣機窒塞，此如《素問·至真要大論篇》：“心胃生寒，胸膈不利，心痛否滿”；另如《蘭室秘藏·中滿腹脹論》謂“脾胃久虛之人，胃中寒則生脹滿，或臟寒生滿病”，故中醫(yī)臨床治療的基本法則亦多以健脾理氣和胃（如香砂六君子湯）為主且療效顯著[6-8]。

香砂六君子湯出自《古今名醫(yī)方論》，主治因脾胃虛弱，氣機阻滯，痰濁、濕毒內(nèi)生而生“痞滿”之效方，亦是體現(xiàn)“健脾理氣和胃”治則治法的經(jīng)典方劑。方中人參補中益氣，健脾養(yǎng)胃；白術健脾燥濕；茯苓健脾滲濕；白術、茯苓合用，能增強健脾除濕功能，促進脾胃運化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理氣消痞而止痛；陳皮、姜半夏燥濕化痰，理氣降逆；甘草調(diào)胃和中，具有補脾和胃、緩急止痛、調(diào)和諸藥作用。本方是中醫(yī)臨床治療CAG的有效方劑。

中醫(yī)認為，脾（胃）主司運化水谷，主要涉及機體消化吸收功能。從現(xiàn)代醫(yī)學病理生理學的角度分析，正常胃黏膜具有分泌胃酸和胃蛋白酶的功能以促進攝入物質(zhì)的初步消化和排空，而CAG患者常因胃黏膜慢性炎性反應，組織充血水腫而胃動力障礙，或因壁細胞數(shù)量逐漸減少，胃黏膜腺體發(fā)生不同程度萎縮，常伴有分泌功能降低[9]，臨床則出現(xiàn)納呆少食、運化遲滯、噯氣胃脹等消化功能障礙的典型癥狀。胃蛋白酶是由胃黏膜主細胞所分泌并存在于胃液中的一種消化性蛋白酶，具有促進機體消化食物的功能。研究表明，CAG患者因胃腺體細胞發(fā)生不同程度的萎縮，其胃液分泌量和胃蛋白酶減少，同時因胃液pH值改變，胃蛋白酶的活性亦減弱，進而導致胃體化學消化功能降低，從而出現(xiàn)納呆少食、運化遲滯及胃脘脹滿之證[10]。同時從病理學角度分析，CAG病程中主要存在胃黏膜慢性炎性反應及不典型增生等變化，而且HIF-1α與慢性炎性反應的關系密切。HIF-1α是廣泛存在于機體細胞中的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[11]，該基因由低氧誘導并介導細胞對缺氧微環(huán)境進行適性反應，缺氧時HIF-1α表達顯著上調(diào)[12]，由此啟動60余種下游因子的轉(zhuǎn)錄以使細胞逐漸適應有氧到缺氧的轉(zhuǎn)變，而且HIF-1α與炎癥反應關系密切，多種致炎細胞因子如白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α、前列腺素E2及脂多糖均能激活HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[13]，參與創(chuàng)傷修復重塑及炎癥等過程。

本研究結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠一般生存情況較差，胃排空功能、胃蛋白酶活性顯著降低，而HIF-1α基因和蛋白表達水平顯著升高，說明大鼠CAG病程中存在胃排空功能紊亂，胃蛋白酶活性下降，而且因胃黏膜組織萎縮、炎性病變表現(xiàn)為缺氧條件下黏膜組織中HIF-1α基因和蛋白高表達；經(jīng)藥物治療后并與模型組比較，香砂六君子湯組大鼠胃排空功能、胃蛋白酶活性顯著升高，HIF-1α基因和蛋白表達下調(diào)，且以香砂六君子湯高劑量作用顯著，提示香砂六君子湯通過調(diào)節(jié)胃排空功能，促進胃蛋白酶活性、下調(diào)缺氧環(huán)境中胃黏膜組織HIF-1α基因和蛋白表達的途徑以防治脾胃虛弱型CAG。

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（收稿日期：2015-07-07；編輯：華強）