新型SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑SPION-DMSA-RGD-99Tcm的合成與生物評價

王曉1,2，崔海平1,2，史旭東1,2，梁積新1，孫鈺林2，申一鳴1,2，沈浪濤1,2,*

(1.中國原子能科學(xué)研究院 國家同位素工程技術(shù)研究中心，北京102413；

2.原子高科股份有限公司，北京102413)

摘要：為制備納米材料SPION-DMSA-RGD及其標(biāo)記物SPION-DMSA-RGD-99Tcm，探討該標(biāo)記物作為SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑的可能性，在水溶性納米顆粒SPION-DMSA上連接c(RGDfC)，得到了SPION-DMSA-RGD，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。用99Tcm對SPION-DMSA-RGD進(jìn)行標(biāo)記，并對該標(biāo)記物進(jìn)行了正常鼠和荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的生物分布研究，及荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的MRI和SPECT顯像研究。研究結(jié)果表明，SPION-DMSA-RGD具有超順磁性，99Tcm標(biāo)記率約為98%。正常鼠和荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的生物分布結(jié)果表明，SPION-DMSA-RGD-99Tcm在血液中清除較快，在肝臟中攝取較高，在腫瘤中有攝取。荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的MRI和SPECT顯像結(jié)果表明，SPION-DMSA-RGD和SPION-DMSA-RGD-99Tcm的腫瘤主動靶向作用明顯。以上結(jié)果提示，對于荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠，SPION-DMSA-RGD-99Tcm是一種SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑。

關(guān)鍵詞：超順磁氧化鐵納米顆粒；二巰基丁二酸；c(RGDfC)；99Tcm；SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑

中圖分類號：O615.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：2014-06-23;修回日期：2014-09-23

作者簡介：王曉(1986—)，女，山西運(yùn)城人，博士研究生，放射性同位素技術(shù)專業(yè)

doi：10.7538/yzk.2015.49.11.1932

*通信作者：沈浪濤，E-mail: shenlt@yahoo.com

Synthesis and Biological Evaluation

of SPECT/MRI Dual-modal Imaging Agent SPION-DMSA-RGD-99Tcm

WANG Xiao1,2, CUI Hai-ping1,2, SHI Xu-dong1,2, LIANG Ji-xin1,

SUN Yu-lin2, SHEN Yi-ming1,2, SHEN Lang-tao1,2,*

(1.NationalIsotopeCenterofEngineeringandTechnology,ChinaInstituteofAtomicEnergy,

Beijing102413,China; 2.AtomHi-TechCo.,Ltd.,Beijing102413,China)

Abstract:In order to investigate the possibility of SPION-DMSA-RGD-99Tcm as a SPECT/MRI dual-modal imaging agent, SPION-DMSA-RGD and its radiolabeled SPION-DMSA-RGD-99Tcm were prepared. SPION-DMSA-RGD was prepared based on SPION-DMSA and c(RGDfC). SPION-DMSA-RGD was characterized by means of various methods. SPION-DMSA-RGD-99Tcm was given by labeling with 99Tcm. The biodistribution studies of SPION-DMSA-RGD-99Tcm in normal mice and the nude mice bearing U87MG human glioma were performed. The MRI and SPECT imaging of SPION-DMSA-RGD and SPION-DMSA-RGD-99Tcm in the nude mice bearing U87MG human glioma were carried out, respectively. The results show that SPION-DMSA-RGD exhibits super-magnetic properties. The labeling yield of SPION-DMSA-RGD with 99Tcm is about 98%. SPION-DMSA-RGD-99Tcm displays fast clearance from the blood and high accumulation in the liver. The tumor uptake of SPION-DMSA-RGD-99Tcm is higher than that of SPION-DMSA-99Tcm. The MRI and SPECT images show that the tumor active targeting of SPION-DMSA-RGD and SPION-DMSA-RGD-99Tcm are obvious. Therefore, SPION-DMSA-RGD-99Tcm can be acting as a SPECT/MRI dual-modal imaging agent for nude mice bearing U87MG human glioma.

Key words：super-magnetic iron oxide nanoparticle; DMSA; c(RGDfC);99Tcm; SPECT/MRI dual-modal imaging agent

提高藥物的腫瘤靶向性一直是藥物學(xué)家的努力方向[1]。人們已對多種腫瘤生物標(biāo)志物進(jìn)行了研究，其中整合素αVβ3特別引人注目[2-4]。在各種類型的人類腫瘤中，整合素αVβ3在約25%的腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等[5-7]。整合素αVβ3在調(diào)節(jié)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成中均發(fā)揮著重要作用。RGD序列多肽(即精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸三肽)能與整合素αVβ3特異性地結(jié)合[8]，且環(huán)狀RGD較線性RGD具有更高的腫瘤親和力和特異性攝取(環(huán)狀RGD的IC50為19.6 nmol/L)[9-11]。

與小分子藥物相比，磁性納米粒子可顯著延長藥物在循環(huán)系統(tǒng)中的滯留時間，通過被動靶向等作用在腫瘤中濃集。磁性納米粒子已被用作藥物載體、磁共振成像(MRI)造影劑等[12]。以磁性氧化鐵納米粒子為核心、合適材料的表面包覆層和腫瘤特異性靶向分子構(gòu)成的多模態(tài)影像劑的研究是當(dāng)前醫(yī)學(xué)影像劑的研究前沿。單光子發(fā)射計算機(jī)斷層成像(SPECT)和磁共振成像(MRI)在臨床醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛，而融合了SPECT和MRI各自優(yōu)點的雙模態(tài)影像技術(shù) SPECT/MRI有望進(jìn)一步提高對腫瘤和其他疾病檢測的靈敏度[13]，具有廣闊的發(fā)展前景。SPECT/MRI雙模態(tài)影像劑的研發(fā)將促進(jìn)SPECT/MRI雙模態(tài)影像技術(shù)的發(fā)展[14]。

最近的研究[15]表明，99Tcm標(biāo)記的水溶性氧化鐵納米粒子SPION-DMSA在腫瘤部位沒有較高的濃集，不是U87MG腫瘤理想的SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑。為改善SPION-DMSA在腫瘤中的靶向作用，本研究將主動靶向分子cyclo-(RGDfC)(c(RGDfC))多肽與SPION-DMSA偶聯(lián)獲得SPION-DMSA-RGD，并經(jīng)放射性核素標(biāo)記得到SPION-DMSA-RGD-99Tcm，評價該標(biāo)記物在正常小鼠和荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布，最終分別進(jìn)行荷瘤裸鼠的SPECT和MRI顯像，以探討SPION-DMSA-RGD-99Tcm作為荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑的可能性。

1實驗材料

1.1儀器及試劑

FD-80型真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；高純水器，美國Millipore公司；IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀，日本Shimadazu公司；JEM2100F透射電鏡，日本電子株式會社；Nano ZS動態(tài)光散射納米粒度分析儀(DLS)，英國Malvern公司；BKT-4500Z振動樣品磁強(qiáng)計，美國Quantum Design公司；1470自動伽瑪計數(shù)器，芬蘭Perkin Elmer公司；CRC-15 R放射性活度計，美國Capintec公司；AR-2000薄層掃描儀，德國Eckert Ziegler公司；NanoScan SPECT/CT，匈牙利MEDISO公司；7.0T小動物磁共振成像儀，美國Varian公司。

c(RGDfC)，純度95%，北京中科亞光生物科技有限公司；N-(氨基乙基)-馬來酰亞胺三氟乙酸鹽(NH2-CH2CH2-MAL·CF3COOH)，純度98%，百靈威公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)，純度98%，TCI公司；Na99TcmO4淋洗液，原子高科股份有限公司；SPION-DMSA，自制[15]。其他化學(xué)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2實驗動物

昆明小白鼠：雌性，重約18～20 g，一級，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠，SPF級，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。取4～5周齡Balb/c雌性裸鼠，右前肢腋下接種5×106個U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，在無菌環(huán)境下飼養(yǎng)，待腫瘤平均直徑達(dá)到8～10 mm時用于實驗。

2實驗方法

2.1SPION-DMSA-RGD的合成與表征

圖1為SPION-DMSA[15]、c(RGDfC)的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖1　SPION-DMSA(a)和c(RGDfC)(b)的結(jié)構(gòu)示意圖 Fig.1　Structures of SPION-DMSA (a) and c(RGDfC) (b)

圖2　SPION-DMSA-RGD合成示意圖 Fig.2　Synthetic route of SPION-DMSA-RGD

SPION-DMSA-RGD是在SPION-DMSA的基礎(chǔ)上引入RGD多肽分子。圖2為SPION-DMSA-RGD的合成示意圖。移取1 mL SPION-DMSA，加入20 μmol EDCI，用0.1 mol/L HCl和NaOH將其pH值調(diào)至5.5～6.0，常溫下反應(yīng)2 h，之后加入18 μmol NH2CH2CH2MAL·CF3COOH，再用0.1 mol/L HCl和NaOH將其pH值調(diào)至8.5～9.0，4 ℃下反應(yīng)18 h。將反應(yīng)液pH值調(diào)至7.0左右，再加入15 μmol c(RGDfC)，常溫下反應(yīng)1 h。反應(yīng)產(chǎn)物用3 500 Da的透析袋在蒸餾水中透析48 h，然后過0.22 μm膜，過膜后得到的液體于真空冷凍干燥機(jī)中凍干，即得SPION-DMSA-RGD粉末。

傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)的測定：取適量凍干后的SPION-DMSA-RGD粉末與KBr混合、研磨后壓片，在IRAffinity-1傅里葉變換紅外光譜儀的樣品艙中進(jìn)行測定。

納米粒子在溶液中的粒徑測定：采用動態(tài)光散射(DLS)法，將1%(w/V)的SPION-DMSA-RGD水溶液倒入石英比色皿中，在Nano ZS納米粒度分析儀的樣品室中用633 nm的He/Ne激光進(jìn)行掃描測定。

樣品的磁性分析：將固體樣品裝入約7 mm的棉簽管中，兩端封口后于BKT-4500Z振動樣品磁強(qiáng)計的樣品艙中進(jìn)行測試。

2.299Tcm的標(biāo)記與質(zhì)控分析

稱取2.4 mg SnCl2·2H2O，加入1 mL 0.1 mol/L的HCl，溶解后取0.05 mL加入小青霉素瓶中，加入1 mL含10 mg NaHCO3的Na99TcmO4洗脫液(活度為1.85×107～7.4×108Bq，pH=8～9)，放置10 min后再加入1 mL SPION-DMSA-RGD (含F(xiàn)e約0.57 mg/mL)水溶液，于室溫下反應(yīng)20 min，整個反應(yīng)過程中均通氮氣保護(hù)。

采用快速薄層色譜(ITLC)法測定SPION-DMSA-RGD-99Tcm的標(biāo)記率，以Whatman 1色層紙為支持體，丙酮為展開劑，展開距離為10 cm，用Bioscan放射性掃描儀測定其放射性分布。

2.3生物分布與顯像

取健康雌性昆明小白鼠16只，隨機(jī)分成4組，每組4只，每只小鼠均經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL(約0.74 MBq)標(biāo)記物，于注射后0.5、1、2、4 h分別摘除眼球取血，繼而斷頸處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肉、骨、腦等臟器稱重，并用γ計數(shù)器測量放射性計數(shù)，經(jīng)衰變校正后，計算百分注射劑量率(%ID/g)。

取荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠9只，隨機(jī)分成3組，每組3只，經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL(約0.74 MBq)標(biāo)記物，于注射后0.5、2、4 h分別摘眼球取血，繼而斷頸處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肉、骨、腦、瘤等稱重，并用γ計數(shù)器測定放射性計數(shù)，經(jīng)衰變校正后，計算百分注射劑量率(%ID/g)及腫瘤與正常組織的攝取率之比(T/NT)。

取荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠4只，隨機(jī)分成2組，每組2只，一組經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL(約37.0 MBq)標(biāo)記物，于給藥后0.5 h和4 h進(jìn)行SPECT顯像，顯像條件為：矩陣尺度256×256，中心能窗140.5 keV。另一組經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL SPION-DMSA-RGD，于注射后0.5 h和4 h進(jìn)行MRI顯像，顯像條件為：視窗，100 mm×100 mm，矩陣尺度，256×256，層厚，1.5 mm，重復(fù)時間3 000 ms，回波時間120 ms。

3結(jié)果與討論

3.1SPION-DMSA-RGD的合成與表征

納米粒子SPION-DMSA(圖1)合成方法參見文獻(xiàn)[15]，其表面游離的羧基可與氨基發(fā)生反應(yīng)從而引入氨基-乙基-馬來酰亞胺，c(RGDfC)中的—SH再與馬來酰亞胺基團(tuán)發(fā)生加成反應(yīng)從而實現(xiàn)多肽與納米粒子的偶聯(lián)。

圖3　SPION-DMSA、SPION-DMSA-RGD 和c(RGDfC)的紅外光譜 Fig.3　FT-IR spectra of SPION-DMSA, SPION-DMSA-RGD and c(RGDfC)

圖4　SPION-DMSA和SPION-DMSA-RGD的 水合動力學(xué)直徑分布 Fig.4　Hydrodynamic diameter distribution of SPION-DMSA and SPION-DMSA-RGD

SPION-DMSA和SPION-DMSA-RGD的DLS分析結(jié)果如圖4所示。強(qiáng)度權(quán)重的DLS顯示均為單峰，即兩種納米粒子的粒徑分別集中在約80 nm和106 nm處。連接了RGD的SPION-DMSA-RGD的粒徑較SPION-DMSA的粒徑略有增大。

SPION-DMSA和SPION-DMSA-RGD的磁性分析結(jié)果如圖5所示。圖5的磁滯回線表明，隨著外加磁場強(qiáng)度的增大，納米粒子的磁化強(qiáng)度增大，當(dāng)外加磁場強(qiáng)度增大到一定值(10 000 Oe)時，磁化強(qiáng)度增速趨緩，逐漸達(dá)到磁飽和。SPION-DMSA和SPION-DMSA-RGD的比飽和磁化強(qiáng)度分別為26.0和19.4 emu/g。由于RGD的偶聯(lián)使SPION-DMSA-RGD的比飽和磁化強(qiáng)度較SPION-DMSA有所減小，但剩磁和矯頑力幾乎可忽略不計，因此，所制得的SPION-DMSA-RGD仍具有良好的超順磁性。該結(jié)果表明，SPION-DMSA-RGD可作為下一步構(gòu)筑SPECT/MRI雙模態(tài)影像劑的良好平臺。

圖5　SPION-DMSA和 SPION-DMSA-RGD的磁滯回線 Fig.5　Hysteresis loops of SPION-DMSA and SPION-DMSA-RGD

3.299Tcm的標(biāo)記率

3.3生物分布與顯像

SPION-DMSA-RGD-99Tcm注入小鼠體內(nèi)后，主要在肝臟聚集，其次在脾和腎，且給藥0.5 h后，標(biāo)記物在肝、脾和腎的攝取都逐漸減少。本研究組最近的研究[15]結(jié)果表明，SPION-DMSA-99Tcm在正常小鼠體內(nèi)的生物分布主要集中在肝、脾和腎，且隨給藥時間的延長，攝取量相應(yīng)減少。該結(jié)果與Fatahian等[17]報道的Fe3O4@DMSA-99Tcm結(jié)果一致。本研究揭示，SPION-DMSA-RGD-99Tcm在正常小鼠體內(nèi)的生物分布與未偶聯(lián)靶向分子c(RGDfC)的納米粒子生物分布[15]基本相同，也主要在肝、脾和腎中聚集。SPION-DMSA-RGD-99Tcm在肝和脾的高攝取主要與星狀巨噬細(xì)胞的吞噬作用有關(guān)。

圖6　 99Tc mO - 4(a)和 SPION-DMSA-RGD- 99Tc m(b)的ITLC譜 Fig.6　ITLC chromatograph of 99Tc mO - 4(a) and SPION-DMSA-RGD- 99Tc m(b)

圖7　SPION-DMSA-RGD- 99Tc m 在荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布 Fig.7　Biodistribution of SPION-DMSA-RGD- 99Tc m in nude mice bearing U87MG human glioma

SPION-DMSA-RGD-99Tcm在荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，給藥0.5 h后，SPION-DMSA-RGD-99Tcm在荷瘤鼠體內(nèi)主要聚集于肝臟((2.03±0.31) %ID/g)，其次為腎((0.65±0.06) %ID/g)和肺((0.63±0.09) %ID/g)；給藥2 h后，主要聚集器官為肝((1.66±0.30) %ID/g)、腎((0.56±0.05) %ID/g)和脾((0.50±0.16) %ID/g))；給藥4 h后，主要聚集器官仍為肝((1.25±0.16) %ID/g)、腎((0.44±0.03) %ID/g)和脾((0.43±0.04) %ID/g)。SPION-DMSA-RGD-99Tcm在腫瘤中的攝取較肌肉中的高，在肝、腎中有較長的滯留時間，而腦部放射性攝取很低。SPION-DMSA-RGD-99Tcm在血液中清除較快，在肝臟中攝取率較高，表明其在體內(nèi)主要經(jīng)肝臟代謝。

SPION-DMSA-RGD-99Tcm在腫瘤中的攝取與未連接c(RGDfC)的SPION-DMSA-99Tcm[15]相比，有明顯提高，給藥0.5 h分別為(0.15±0.008) %ID/g和(0.04±0.006) %ID/g，給藥2 h分別為(0.10±0.009) %ID/g和(0.03±0.001) %ID/g，給藥4 h分別為(0.05±0.001) %ID/g和(0.03±0.002) %ID/g。這表明連接上c(RGDfC)后，納米粒子對腫瘤具有明顯的靶向作用。

在3個時間點中，腫瘤與腦的T/NT在給藥2 h后達(dá)到最高，為8.38，而腫瘤與肌肉的T/NT此時最低，為3.78；給藥4 h后，腫瘤與肌肉的T/NT升高為4.45，而腫瘤與腦的T/NT降低至7.48，但仍大于7，這表明由于納米的特性，SPION-DMSA-RGD-99Tcm在腫瘤組織中具有較長的滯留時間，靶與非靶組織的反差較大，有望在較寬的時間范圍內(nèi)作為腫瘤靶向顯像劑。

荷U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠靜脈注射SPION-DMSA-RGD-99Tcm后，0.5 h和4 h的顯像結(jié)果如圖8所示，圖中箭頭所指部位為腫瘤。從圖8中SPECT圖像可見，靜脈注射0.5 h后，腫瘤部位已有明顯攝取，4 h后腫瘤部位攝取范圍有所增加。這說明在SPECT模態(tài)下，SPION-DMSA-RGD-99Tcm可用作U87MG腫瘤的SPECT顯像劑。

超順磁性氧化鐵納米粒子在MRI成像中為T2顯像劑。從圖8可見，與未注射SPION-DMSA-RGD的荷瘤裸鼠相比，注射SPION-DMSA-RGD 0.5 h后，腫瘤部位變暗，4 h后腫瘤部位變暗更明顯，表明腫瘤部位有攝取。這說明在MRI模態(tài)下，SPION-DMSA-RGD可作為U87MG腫瘤的T2MRI顯像劑。

圖8　靜脈注射SPION-DMSA-RGD- 99Tc m 和SPION-DMSA-RGD前后荷U87MG 人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤裸鼠的SPECT和MRI圖像 Fig.8　SPECT and MRI images of SPION-DMSA-RGD- 99Tc m and SPION-DMSA-RGD in nude mice bearing U87MG human glioma before and after intravenous injection

對照未連接c(RGDfC)的SPION-DMSA情形[15]，注射SPION-DMSA-RGD-99Tcm后，無論在SPECT模態(tài)還是在MRI模態(tài)下，均表現(xiàn)出了明顯的靶向作用，即顯像劑在U87MG腫瘤部位均有較高的聚集。這種腫瘤靶向作用可能與RGD多肽的主動靶向有關(guān)，因為在U87MG腫瘤細(xì)胞中有過度表達(dá)能與RGD多肽特異結(jié)合的整合素αVβ3[18]。

綜合圖8中SPECT和MRI的顯像研究結(jié)果，顯而易見，SPION-DMSA-RGD-99Tcm在腫瘤中有明顯的濃集，可作為一種新型的U87MG腫瘤SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

1) 成功制備了SPION-DMSA-RGD及其標(biāo)記物SPION-DMSA-RGD-99Tcm。

2) SPION-DMSA-RGD-99Tcm在血液中清除較快，在肝臟中攝取率較高，表明其主要經(jīng)肝臟代謝。

3) SPION-DMSA-RGD-99Tcm與SPION-DMSA-99Tcm相比，對U87MG人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤有明顯的主動靶向作用。

4) SPECT和MRI圖像顯示，SPION-DMSA-RGD-99Tcm是具有U87MG腫瘤靶向作用的新型SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑。SPION-DMSA-RGD-99Tcm作為一種新型的SPECT/MRI雙模態(tài)顯像劑，其自身性能的持續(xù)改善及對其他腫瘤的適用性還有待進(jìn)一步研究。

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