甘氨酸受體α1亞基在乳鼠心肌細胞的表達及損害性因素對其表達的影響*

陳楚天1△，陸大祥2，戚仁斌2，王華東2

(1廣東省公共衛(wèi)生研究院,廣東 廣州511430；2暨南大學醫(yī)學院病理生理教研室，廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 研究甘氨酸受體α1亞基(GlyRα1)在乳鼠心肌細胞中的表達以及脂多糖(LPS)、缺氧/復(fù)氧(H/R)、異丙腎上腺素(ISO)和高糖(HG)對其表達的影響。方法: 體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，Western blotting方法檢測心肌細胞上GlyRα1的表達；心肌細胞分別用LPS、H/R、ISO以及HG處理24 h，采用CCK-8試劑檢測細胞活力，Western blotting方法檢測心肌細胞上GlyRα1的表達。結(jié)果: Western blotting 方法檢測到乳鼠心肌細胞上GlyRα1的表達；LPS(20 mg/L)、ISO(100 μmol/L)以及HG(25mmol/L)處理心肌細胞24 h與心肌細胞H/R 3 h對心肌細胞存活率無明顯影響；LPS組、H/R 3 h組以及ISO組心肌細胞上GlyRα1表達均高于對照組(P<0.01)，而HG組心肌細胞上GlyRα1表達低于對照組(P<0.01)。結(jié)論: 乳鼠心肌細胞上存在GlyRα1，并且一定濃度的LPS、ISO與一定時間的H/R均可上調(diào)乳鼠心肌細胞GlyRα1的表達，而HG可下調(diào)乳鼠心肌細胞GlyRα1的表達。

[關(guān)鍵詞]甘氨酸受體α1； 脂多糖； 缺氧/復(fù)氧； 異丙腎上腺素； 高糖

[中圖分類號]R363[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.013

[文章編號]1000-4718(2015)11-2009-07

[收稿日期]2015-04-22[修回日期] 2015-09-21

[基金項目]*遼寧省教育廳科學研究一般項目(No. L2013399)；沈陽醫(yī)學院博士科研啟動基金資助項目(No. 20133050)

通訊作者△Tel: 024-62217129; E-mail: sunflowerzlq@163.com

Effects of several harmful factors on expression of glycine receptor α1subunit in neonatal rat myocardial cellsCHEN Chu-tian1, LU Da-xiang2, QI Ren-bin2, WANG Hua-dong2

(1GuangdongProvincialInstituteofPublicHealth,Guangzhou511430,China;2DepartmentofPathophysiology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:cct104@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To study the expression of glycine receptor α1 subunit in neonatal rat myocardial cells and to investigate the effect of lipopolysaccharide (LPS), hypoxia/reoxygenation, isoproterenol (ISO) and high concentration of glucose (HG) on the expression of glycine receptor α1 subunit in the neonatal rat myocardial cells. METHODS: Neonatal rat myocardial cells were cultured in vitro. The expression of glycine receptor α1 subunit was detected by Western blotting. The neonatal rat myocardial cells were treated with LPS (20 mg/L), ISO (100 μmol/L) or high concentration of glucose (25 mmol/L) for 24 h, or were exposed to hypoxia for 3 h followed by reoxygenation for 3 h. Subsequently, the cell viability was measured by CCK-8 assay， and the expression of glycine receptor α1 subunit was determined by Western blotting. RESULTS: The expression of glycine receptor α1 subunit in the neonatal rat myocardial cells was positively detectable by Western blotting. Compared with control group, no significant difference of the cell viability (P>0.05) in LPS group, ISO group, hypoxia/reoxygenation group and HG group was observed. The expression of glycine receptor α1 subunit was increased (P<0.01) in LPS group, ISO group and hypoxia/reoxygenatio group, but decreased (P<0.01) in HG group. CONCLUSION: Glycine receptor α1 subunit exists in the neonatal rat myocardial cells. A certain concentration of LPS or ISO, or hypoxia/reoxygenation for a certain period upregulate the expression of glycine receptor α1 subunit, but HG downregulates the expression of glycine receptor α1 subunit in cultured neonatal rat myocardial cells.

[KEY WORDS]Glycine receptor α1subunit; Lipopolysaccharides; Hypoxia/reoxygenation; Isoproterenol; High concentration of glucose

我們先前的研究發(fā)現(xiàn)，甘氨酸(glycine，Gly)對缺血/再灌注損傷的心臟[1]、缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷的心肌細胞以及脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)損傷的心臟和心肌細胞都有保護作用[2]，通過大量研究，我們認為Gly對心臟的保護作用是由心肌細胞上的甘氨酸受體(glycine receptor, GlyR)介導(dǎo)的。內(nèi)毒素血癥、缺血/再灌注、交感神經(jīng)系統(tǒng)的過度激活與高血糖是臨床上常見的心肌損傷因素。我們先前的研究表明，乳鼠心肌細胞甘氨酸受體α1亞基(GlyRα1)mRNA的表達水平受這些損傷因素的調(diào)節(jié)[3]，然而，與之相應(yīng)的，這些損傷因素可否影響心肌GlyRα1蛋白的表達水平尚缺乏研究。因此，本研究旨在觀察LPS、H/R、異丙腎上腺素(isoproterenol, ISO)以及高糖(high concentration of glucose，HG)對乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白表達的影響。

材料和方法

1主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo)、酶標儀(Tecan)、Western blotting蛋白印跡電泳儀和蛋白印跡電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)

2藥品和試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(中國醫(yī)學科學院血液學研究所產(chǎn)品);胰蛋白酶(Hyclone)；CCK-8試劑(日本同仁化學研究所)；GlyRα1多克隆抗體(Abcam)；天然膜蛋白抽提試劑盒(BioVision)；ECL發(fā)光液(Pierce)；LPS(Sigma)；ISO(上海禾豐制藥有限公司)；葡萄糖(天津化學試劑一廠)。

3方法

3.1心肌細胞培養(yǎng)無菌條件下取出出生1～3 d SD大鼠乳鼠(中山大學實驗動物中心)心臟，取心室肌剪碎,0.125%胰蛋白酶消化成單細胞懸液,離心棄上清,用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮分散細胞,100目篩網(wǎng)過濾,將細胞懸液接種于25 mL培養(yǎng)瓶中,在CO2孵箱中(95% O2,5% CO2,37℃)培養(yǎng)90 min后,棄去貼壁的成纖維細胞，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 制成(1～5)×105cells/L細胞懸液接種于另一培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中,每24 h換液1次,72 h后,選取搏動良好的心肌細胞進行實驗。

3.2乳鼠心肌與脊髓組織的提取乳鼠脫頸致死后, 快速取出心臟與腰骶段脊髓(L5～S1)于液氮中保存，用勻漿器將組織勻漿，抽提總蛋白。

3.3心肌細胞缺氧/復(fù)氧(H/R)模型的建立[4]參照文獻的方法。實驗組心肌細胞用混合氣體(95%N2,5%CO2)預(yù)先飽和1 h的模擬缺血溶液(137 mmol/L NaCl，12 mmol/L KCl，0.9 mmol/L CaCl2·2H2O，0.49 mmol/L MgCl2，20 mmol/L乳酸鈉，0.4 mmol/L HEPES，pH 6.2)置換正常培養(yǎng)液，放入缺氧裝置中，充入混合氣體(95% N2,5% CO2)后密封，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 h，即為缺氧模型。3 h后用正常培養(yǎng)液置換缺氧液，開放瓶口，放入常氧環(huán)境中培養(yǎng)3 h，即為復(fù)氧模型。

3.4實驗分組心肌細胞培養(yǎng)72 h后隨機分為5組。對照組、LPS(20 mg/L)組、ISO(100 μmol/L)組和HG(25 mmol/L葡萄糖)組分別培養(yǎng)心肌細胞24 h，H/R組的心肌細胞進行缺氧3 h后復(fù)氧3 h處理。

3.5細胞活性的測定以1×105cells/L細胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板中,每組設(shè)6復(fù)孔，72 h后按上述分組進行培養(yǎng)。H/R組按上述H/R模型的方法缺氧3 h后復(fù)氧3 h；LPS、ISO和HG組加入相應(yīng)濃度的LPS、ISO和葡萄糖培養(yǎng)24 h;每孔加入10 μL CCK-8試劑，微量振蕩器振蕩5 min, 置于CO2培養(yǎng)箱中(95% O2，5% CO2,37 ℃)培養(yǎng)30 min，用酶標儀檢測每孔液體的吸光度(A)值。細胞存活率(%)=(A實驗-A空白)/(A對照-A空白)×100%。

3.6Western blotting 檢測心肌細胞GlyRα1蛋白的表達分別抽提乳鼠心肌細胞、心肌組織與脊髓組織總蛋白，BCA法測量蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，封閉，抗體孵育(GlyRα1和GAPDH抗體稀釋比例分別是1∶250 和1∶1 000)，采用化學發(fā)光法顯色，用專用軟件對蛋白條帶灰度值進行分析。

4統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0軟件分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示,組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1LPS、H/R、ISO以及HG對心肌細胞活性的影響

如表1所示，LPS組、ISO組、HG組和H/R組心肌細胞存活率與對照組比較無顯著差別。

2乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白的表達

乳鼠心肌細胞、心肌組織和脊髓組織(陽性對照)均有GlyRα1蛋白表達，見圖1。

表1四種損害性因素對乳鼠心肌細胞毒性的測定

Table 1.Effects of four harmful factors on survival rate of neonatal rat myocardial cells (%. Mean±SD.n=6)

GroupCellsurvivalrateControl90.80±2.63LPS90.55±1.92H/R91.27±2.54ISO90.86±2.81HG90.46±2.80

Figure 1.Western blotting for GlyRα1protein expression.

圖1乳鼠心肌細胞、心肌組織與脊髓組織GlyRα1蛋白的表達

3LPS、H/R、ISO以及HG對乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白表達的影響

Western blotting結(jié)果分析顯示，與對照組相比，LPS、ISO和H/R均可增加GlyRα1蛋白的表達，而HG可降低GlyRα1蛋白的表達(P<0.01),見圖2。

Figure 2.Effects of LPS, H/R, ISO and HG on GlyRα1protein expression in cultured neonatal rat myocardial cells. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol.

圖2LPS、H/R、ISO和HG作用下乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白表達的變化

討論

本室先前的研究表明Gly對缺血/再灌注損傷的心臟、缺氧/復(fù)氧損傷的心肌細胞的保護作用通過心肌細胞上GlyR介導(dǎo)實現(xiàn)的，而對GlyR各亞基功能的研究表明，α亞基因其含有與激動劑、拮抗劑結(jié)合的位點而成為GlyR功能的決定因子[5-7]，本人先前的研究表明，乳鼠心肌細胞GlyRα1mRNA的表達水平受LPS、H/R、ISO以及HG這些損傷因素的調(diào)節(jié)，本次實驗是在先前的實驗結(jié)論的基礎(chǔ)上進一步探討GlyRα1蛋白在乳鼠心肌細胞的表達，以及以上損害因素對其蛋白水平表達的影響。

1乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白的表達

在生物體CNS上GlyRα1蛋白的表達早已得到多數(shù)學者的證實，而對于心肌細胞上是否有GlyRα1蛋白的表達尚未得到證實。本室先前對GlyR的研究發(fā)現(xiàn)，采用靈敏度較高的逆轉(zhuǎn)錄-巢式聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)在乳鼠心肌細胞上能夠檢測到GlyRα1mRNA的表達，但在應(yīng)用Western blotting方法進一步驗證此研究結(jié)果時卻未能發(fā)現(xiàn)有相同的免疫活性和分子量大小的蛋白存在，這使得本研究在實驗方案和實驗技術(shù)方面具有相當大的挑戰(zhàn)性。本研究在檢測GlyRα1蛋白的表達時，采用提高心肌細胞膜蛋白的濃度、調(diào)整Ⅰ抗和Ⅱ抗的最佳反應(yīng)濃度等方法最終成功地首次檢測到心肌細胞GlyRα1蛋白的表達，不僅完善了本室前期的工作，而且也是本研究的重要部分是否能夠順利開展的關(guān)鍵之處。本研究表明乳鼠心肌細胞上不但有GlyRα1蛋白的表達，并且受損害性因素的調(diào)節(jié)。

2損害性因素對乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白表達的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，乳鼠心肌細胞在20 mg/L LPS處理24 h后、100 μmol/L ISO處理24 h后與H/R(各3 h)處理下(細胞存活率不受影響)均可增加GlyRα1蛋白水平的表達，提示一定濃度的LPS、ISO以及一定時間的H/R可通過上調(diào)GlyRα1的表達來正性調(diào)節(jié)GlyR的功能；25 mmol/L葡萄糖處理乳鼠心肌細胞24 h后，細胞存活率不受影響，GlyRα1蛋白水平的表達低于對照組，該結(jié)果提示HG可下調(diào)GlyRα1的表達，從而負性調(diào)節(jié)GlyR的功能。以上研究結(jié)果與我們之前的研究結(jié)果一致，即一定濃度的LPS、ISO以及一定時間的H/R可通過上調(diào)GlyRα1mRNA的表達水平來正性調(diào)節(jié)GlyR的功能，而HG可下調(diào)GlyRα1mRNA的表達水平，從而負性調(diào)節(jié)GlyR的功能。

近年來對GlyR的深入研究發(fā)現(xiàn)，GlyR的功能隨著機體發(fā)育階段的變化而變化。在機體神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育早期與成熟期，GlyR的激活對神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)有著截然不同的作用，并且與細胞內(nèi)Ca2+的濃度密切相關(guān)[8-9]。在機體的神經(jīng)元成熟期，細胞內(nèi)Cl-濃度低于平衡濃度，此時激活GlyR的Cl-通道引發(fā)Cl-內(nèi)流，表現(xiàn)為抑制效應(yīng)；而對于發(fā)育早期而言，細胞內(nèi)Cl-濃度高于平衡濃度，此時激活GlyR的Cl-通道引發(fā)Cl-外流，膜去極化，興奮神經(jīng)元，繼而興奮電壓依從性Ca2+通道，Ca2+內(nèi)流，細胞內(nèi)Ca2+的濃度增加可使細胞產(chǎn)生特異的功能[10-11]。Fucile等[12]在大鼠脊髓神經(jīng)元和轉(zhuǎn)染人細胞系發(fā)現(xiàn)了一個能夠快速增效GlyR功能的因素——細胞內(nèi)Ca2+，此快速增強作用的發(fā)展時程小于100 ms并與Ca2+內(nèi)流相一致，該研究提示細胞內(nèi)Ca2+能夠明顯增加GlyR與Gly的親和力來上調(diào)GlyR的功能。這些研究結(jié)論與本實驗的LPS、H/R、ISO這3種因素對GlyRα1mRNA表達影響的結(jié)果相一致。本實驗中的4種因素造成心肌細胞損傷的共同機制之一是引發(fā)細胞內(nèi)鈣超載，隨著損傷因素濃度的增高心肌細胞內(nèi)Ca2+的濃度也逐漸增加，心肌細胞內(nèi)Ca2+的濃度逐漸增加進而激活GlyR表達的逐漸增多，從而上調(diào)GlyR的功能。但是HG對GlyRα1mRNA表達的影響卻與此相反，這可能與HG所致心肌損傷的諸多中間機制有關(guān)。研究證實，HG(20 mmol/L、30 mmol/L)明顯抑制乳鼠心肌細胞?；撬徂D(zhuǎn)運[13]，而牛磺酸與Gly結(jié)構(gòu)相似，同是GlyR的激動劑，HG可能通過抑制了與?；撬峤Y(jié)構(gòu)相似的GLy轉(zhuǎn)運來抑制GlyR的表達，下調(diào)了GlyR的功能。

本實驗研究表明，一定濃度的LPS與ISO以及一定時間的H/R均能增加乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白水平的表達；而HG能夠使乳鼠心肌細胞GlyRα1蛋白水平的表達減少。提示這些損傷心肌的因素能夠調(diào)節(jié)GlyR的功能，其確切機制還需深入研究。

[參考文獻]

[1]周瓊，陸大祥，付詠梅，等.甘氨酸對小鼠心肌缺血性損傷的防治作用研究[J].中國病理生理雜志，2002，18(4)：360-362.

[2]張齊好，陸大祥，王華東，等.甘氨酸對心肌缺血-再灌注小鼠一氧化氮系統(tǒng)和bcl-2 mRNA 表達的影響[J].中國病理生理雜志，2004，20(1):42-46.

[3]陳楚天，陸大祥，戚仁斌，等. 損害性因素對乳鼠心肌細胞甘氨酸受體α1亞基表達的影響[J]. 中國病理生理雜志，2008，24(5)：843-848.

[4]Brar BK, Stephanou A, Liao Z, et al．Cardiotrophin-1 can protect cardiac myocytes from injury when added both prior to simulated ischaemia and at reoxygenation[J]. Cardiovascular Research, 2001,51(2):265-274.

[5]Kuhse J, Betz II, Kirsch J. The inhibitory glycine receptor: architecutre, synaptic localization and molecular pathology of a postsynaptic ion-channel complex[J]. Curr Opin Neurobiol, 1995,5(3): 318-323.

[6]Vandenberg RJ, French CR, Barry PH, et al. Antagonism of ligand-gated ion channel receptors: two domains of the glycine receptor a subunit form the strychnine-binding site[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89(5): 1765-1769 .

[7]Harvey RJ, Depner UB, W?ssle H, et al. GlyR α3: an essential target for spinal PGE2-mediated inflammatory pain sensitization[J]. Science, 2004, 304(5672): 884-887.

[8]Kilb W, Ikeda M, Uchida K, et al. Depolarizing glycine responses in Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex[J]. Neuroscience, 2002,112(2):299-307.

[9]Laube B, Maksay G, Schemm R, et al. Modulation of glycine receptor function: a novel approach for therapeutic intervention at inhibitory synapses?[J]. Trends Pharmacol Sci, 2002,23(11):519-527.

[10]Eilers J, Plant TD, Marandi N, et al. GABA-mediated Ca2+signalling in developing rat cerebellar Purkinje neurones[J]. J Physiol, 2001, 536(2):429-437.

[11]Kanaka C, Ohno K, Okabe A, et al. The differential expression patterns of messenger RNAs encoding K-Cl cotransporters (KCC1,2) and Na-K-2Cl cotransporter (NKCC1) in the rat nervous system[J]. Neuroscience, 2001,104(4):933-946.

[12]Fucile S, De Saint Jan D, de Carvalho LP, et al. Fast potentiation of glycine receptor channels by intracellular calcium in neurons and transfected cells[J]. Neuron, 2000, 28(2): 571-583.

[13] Shi YR, Gao L, Wang SH, et al.Inhibition of taurine transport by high concentration of glucose in cultured rat cardiomyocytes[J]. Metabolism, 2003, 52(7): 827-833.

(責任編輯： 林白霜， 羅森)