·短篇論著·

胰腺癌細(xì)胞中miR-27a靶基因的確定及其意義

王慧玲侯寶華區(qū)金銳

MicroRNA(miRNA)通過作用于靶基因在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著癌基因和抑癌基因作用[1-2]。靶基因的預(yù)測與鑒定對于腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究有著重要意義。胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展與miRNA的關(guān)系密切，有研究報道，胰腺癌組織中的miR-27a明顯高表達(dá)[3]。本研究結(jié)合生物信息學(xué)軟件，篩選并驗證胰腺癌中miR-27a可能的靶基因。

一、材料與方法

1．細(xì)胞株及載體：人胰腺癌PANC1細(xì)胞系和HEK293T細(xì)胞均取自廣東省人民醫(yī)院腫瘤中心實驗室，常規(guī)培養(yǎng)傳代。pmirGLO雙熒光素酶報告基因載體購自Promega公司。

2．含靶基因質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：采用生物信息學(xué)預(yù)測軟件Targetscan和miRanda分別對miR-27a進(jìn)行靶基因預(yù)測，并且結(jié)合差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，選擇合適的靶基因。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測的靶基因和miR-27a結(jié)合位點(diǎn)，以人類基因組DNA為模板擴(kuò)增SMAD4的3′UTR的部分序列，利用DNAclub設(shè)計引物序列，在引物中引入XhoⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。引物序列上游為5′-TGTCTCGAGAGACCATCCTAGAAACCAC-3′，下游為5′-TGTGTCGACGATCATACCACTGCACTCC-3′。PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳驗證，目的條帶用DNA膠回收試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化回收。根據(jù)之前設(shè)計的雙酶切位點(diǎn)將回收的目的片段與pmirGLO載體分別經(jīng)過雙酶切、連接后構(gòu)建重組質(zhì)粒pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒(wt)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，挑取陽性克隆37℃培養(yǎng)過夜后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切和測序鑒定。取上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒pmirGLO-SMAD4，與miR-27a結(jié)合區(qū)域第3、4、5個堿基進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建突變型質(zhì)粒pmirGLO-SMAD4(mut)，按賽百盛堿基突變試劑盒說明書操作，并測序鑒定。

3．細(xì)胞轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶活性檢測：取對數(shù)生長期HEK293T細(xì)胞，以每孔4×105個細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后(細(xì)胞融合度達(dá)到60%)分別將miR-27a mimic、陰性對照的miRNA-NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)與pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒(wt)/(mut)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent試劑盒(TaKaRa公司)

DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2015.02.017

基金項目：衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費(fèi)項目(201202007)

作者單位：510080廣州，廣東省人民醫(yī)院普通外科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院

通信作者：區(qū)金銳，Email: whlhandsome@163.com

說明書操作。培養(yǎng)36 h后收集細(xì)胞，用RIPA裂解液(Pierce公司)裂解細(xì)胞，采用熒光素酶基因報告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司)通過多功能酶標(biāo)儀檢測螢火蟲熒光素酶活性值(F)和海腎熒光素酶活性值(R)，熒光素酶相對活性以F/R值表示。實驗重復(fù)3次。

4．SMAD4蛋白表達(dá)檢測：將胰腺癌細(xì)胞PANC1接種于6孔板培養(yǎng)24 h(細(xì)胞融合度達(dá)到60%)，分別將miR-27a mimic、miRNA-NC瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h后，提取細(xì)胞的總蛋白。BCA法蛋白定量后，取30 μg常規(guī)行蛋白質(zhì)印跡法檢測SMAD4蛋白表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參。兔抗人SMAD4單抗(Cell Signaling Technology公司)工作濃度1∶1 000，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(聚研生物科技有限公司)工作濃度1∶5 000。以目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值比表示蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

二、結(jié)果

1．MiR-27a靶基因結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測：經(jīng)TargetScan和miRanda兩種方法預(yù)測，miR-27a與SMAD4 mRNA 3′端UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合(圖1)。經(jīng)miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫-TarBase v．5c篩查及國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)檢索，確定SMAD4與miR-27a的關(guān)系尚未見報道。

圖1　TargetScan(1A)、miRanda(1B)生物信息學(xué)軟件預(yù)測的miR-27a與SMAD4 mRNA 3′UTR的堿基互補(bǔ)序列(豎線部分)

2．pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒及其突變質(zhì)粒的鑒定：構(gòu)建的pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒(wt)，經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定擴(kuò)增片段序列正確(圖2)。將pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒的SMAD4 3′UTR的結(jié)合區(qū)域第3、4、5位堿基的TGT突變?yōu)锳CG(圖3)，突變后的質(zhì)粒送測序，證實突變成功。

3．熒光素酶活性：pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒與miR-27a共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶相對活性為0.540±0.041，顯著低于與miR-NC共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的1.147±0.089，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.154，P=0.003)。突變型pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒與miR-27a共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶相對活性為1.097±0.018，它與miR-NC 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性1.111±0.058的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.238，P=0.82)。

圖2　PCR 產(chǎn)物(2)及雙酶切產(chǎn)物(3)的瓊脂糖凝膠電泳圖

圖3　突變型pmirGLO-SMAD4質(zhì)粒的突變堿基序列(下劃線標(biāo)注)

4．MiR-27a轉(zhuǎn)染對PANC1細(xì)胞SMAD4蛋白表達(dá)的影響：轉(zhuǎn)染miR-27a的PANC1細(xì)胞的SMAD4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(圖4)。

圖4　轉(zhuǎn)染miR-NC(1)及轉(zhuǎn)染miR-27a(2)的PANC1細(xì)胞的SMAD4蛋白表達(dá)

討論MiRNA是非編碼RNA，作為轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)分子作用于靶基因，促進(jìn)mRNA的降解或抑制翻譯，從而抑制靶基因的表達(dá)。大量研究表明[4-6]，多數(shù)腫瘤存在miRNA表達(dá)譜的改變，胰腺癌同樣也存在這一現(xiàn)象[5-6]，因此研究miRNA在胰腺癌發(fā)病機(jī)制中的作用具有重要意義。

根據(jù)前期篩查實驗的結(jié)果[3]，并結(jié)合文獻(xiàn)報道，本研究選擇了在胰腺癌組織中明顯上調(diào)的miR-27a作為研究對象。結(jié)果顯示，含SMAD4質(zhì)粒與miR-27a共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性明顯降低，轉(zhuǎn)染miR-27a的PANC1細(xì)胞的SMAD4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，證實miR-27a為SMAD4的靶基因，且對SMAD4進(jìn)行靶向負(fù)調(diào)控。

SMAD4位于TGF-β信號通路的中樞位置，是TGF-β/SMAD通路的關(guān)鍵應(yīng)答分子，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[7-8]。SMAD4在消化道腫瘤尤其是胰腺癌中的突變率和缺失率最高。Hahn等[9]報道了胰腺癌組織中SMAD4同源缺失或突變現(xiàn)象，認(rèn)為這種缺失或突變是癌前病變進(jìn)展為胰腺癌的關(guān)鍵因素，并且是胰腺癌診斷中的一個重要標(biāo)志物。另一文獻(xiàn)[10]通過動物實驗證實SMAD4會加速胰腺癌的發(fā)生發(fā)展。此外，臨床資料也表明，SMAD4與腫瘤臨床病理特征及患者預(yù)后密切相關(guān)[11-12]。

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收稿日期：(2014-12-11)

(本文編輯：呂芳萍)