■張廣亮 劉大森，2 呂宗浩 黃國欣 杜江華

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

固氮菌是指具有生物固氮能力的細(xì)菌，根據(jù)習(xí)性被分為自生固氮菌、聯(lián)合固氮菌和共生固氮菌。在科學(xué)界，對固氮菌的研究以在植物和土壤方面居多(Hurek等,1997;Bellenger等,2014)，但隨著生物固氮研究的深入，很多研究者們在動(dòng)物體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了固氮菌的存在，如Bergersen等（1970）在動(dòng)物的腸道中分離到了具有固氮能力的細(xì)菌。反芻動(dòng)物瘤胃微生物擔(dān)負(fù)著降解飼料等重要作用，自然對其研究比較多。但是，目前對瘤胃固氮菌分離和作用等研究還很少。Jones等（1974）和紀(jì)金春（1993）分別從山羊和綿陽瘤胃液中分離出具有固氮能力的細(xì)菌；冀德君等（2006）從山羊的瘤胃液中分離到了兼性厭氧的固氮菌，并做了初步鑒定；李昊等（2013）和仝泳等（2014）分別在奶牛瘤胃液中分離到了兼性厭氧的固氮菌，對菌株進(jìn)行了初步鑒定，并發(fā)現(xiàn)兼性厭氧固氮菌和纖維菌混合添加比只添加纖維菌有益于瘤胃發(fā)酵。然而，現(xiàn)有研究都是有關(guān)瘤胃液的兼性厭氧固氮菌，缺少瘤胃飼料殘?jiān)写祟惥难芯俊?/p>

本試驗(yàn)將從瘤胃液和瘤胃殘?jiān)蟹蛛x兼性厭氧固氮菌，通過固氮酶活性，生理生化和分子鑒定指標(biāo)，對瘤胃液和瘤胃殘?jiān)屑嫘詤捬豕痰M(jìn)行比較研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來源

本試驗(yàn)菌株是從3頭裝有永久性瘤胃瘺管、體況良好的荷斯坦奶牛采集的瘤胃液和瘤胃殘?jiān)蟹謩e進(jìn)行分離。

1.1.2 培養(yǎng)基

無氮固體培養(yǎng)基：每升含0.5 g Na2MoO4、1.36 g KH2PO4、2.13 g Na2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、0.1 g Ca-Cl2、0.2 g NaCl、0.01 g FeCl3、180 g純化瓊脂粉。

LB液體培養(yǎng)基：每升含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g NaCl，pH值7.2。

1.1.3 主要試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Code No.9763）購買自大連寶生物有限公司；PCR Premix溶液購買自北京金唯智生物有限公司；所用PCR引物由上海生工合成；16S rDNA測序工作由北京金唯智公司完成。

1.1.4 主要儀器

超級(jí)潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，DL-CJ-2ND型）；二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司，MCO-15AC型）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，LRH-250F）；氣相色譜儀（SHIMADZU,GC-2010型）；基因擴(kuò)增儀（東勝創(chuàng)新生物有限公司，EDC-810）；電泳儀[EPS 601 POWER SUPPLY型，美國GE（瑞典amersham/pharmacia）]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離和純化

在晨飼前采集瘤胃內(nèi)容物，利用四層紗布將瘤胃液與瘤胃殘?jiān)蛛x，瘤胃液和瘤胃殘?jiān)謩e在保溫容器內(nèi)保存，迅速返回試驗(yàn)室無菌操作臺(tái)中操作。稱10 g瘤胃殘?jiān)苋?0 ml無菌水，為10-1，搖床搖20 min，之后與瘤胃液原液分別用無菌生理鹽水倍比稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5倍后涂布于無氮固體培養(yǎng)基中，39℃厭氧培養(yǎng)48 h后，在10-2和10-3倍稀釋情況下培養(yǎng)良好，挑取不同的單個(gè)菌落進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，劃線接種于無氮固體培養(yǎng)基上，于39℃在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，反復(fù)多次，后又在有氧條件下培養(yǎng)幾次，直到在顯微鏡觀察下已經(jīng)純化。純化后，觀察菌落特征（大小、顏色、形狀、邊緣、透明度等）并用革蘭氏法染色判斷陰陽性和用孔雀石綠染色判斷有無芽孢。生化鑒定參照《伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》，利用杭州天和生物公司的細(xì)菌生化微量鑒定管進(jìn)行生化鑒定。

1.2.2 固氮酶活性的測定

采用乙炔還原法進(jìn)行固氮酶活性的測定。將菌株在平板無氮固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，用接種環(huán)挑取10個(gè)單個(gè)菌落劃線于試管中的斜面無氮培養(yǎng)基上。39℃培養(yǎng)72 h后將棉塞換成橡膠塞，注入乙炔氣體（最終濃度為10%,V/V），繼續(xù)培養(yǎng) 72 h，取100 μl反應(yīng)氣體用氣相色譜儀測定其乙炔還原量(乙烯生成量)，并折算成固氮酶的活性（周建嬌，2013）。不接種空白培養(yǎng)基為陰性對照。

1.2.3 16S rDNA測序

菌株基因組DNA的提取，采用購買的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作（Code No.9763）。16S rDNA基因序列的PCR擴(kuò)增，采用通用的簡并引物：上游引物27F:5'AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3'，下游引物1492R:5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'。PCR反應(yīng)在50 μl標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系中進(jìn)行（Code No.RR902A），PCR擴(kuò)增條件為：首先，95℃預(yù)變性5 min；然后，95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)30次；最后，72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物置于4℃保存。取3 μl PCR產(chǎn)物和適量的Lording buffer混合進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，Marker為DL 2000，將純化（只有單一條帶）的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京金唯智生物科技有限公司測序。將測序結(jié)果在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上用BLAST軟件在Gen Bank中進(jìn)行同源性分析和菌株序列號(hào)的申請，與相近典型菌株的基因序列相似度在99%以上可以判定與比較菌種為同一種屬，否則為同屬下的新亞種。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生理生化特征

從瘤胃液和瘤胃殘?jiān)蟹謩e篩選出6株固氮菌（編號(hào)從LY-1到LY-6）和4株固氮菌（編號(hào)從LC-1到LC-4），且這10株固氮菌均為兼性厭氧菌。10株固氮菌的革蘭氏染色和芽孢染色的結(jié)果見表1，就革蘭氏染色指標(biāo)看，從瘤胃液中分離到了2株菌為革蘭氏陽性菌，其余都為陰性菌，然而，瘤胃殘?jiān)蟹蛛x的均為革蘭氏陰性菌。從兩種來源都各自分離到了1株有芽孢的菌株，分別是LY-1和LC-1。生化鑒定結(jié)果見表2，在生化結(jié)果中，各菌株有些不同。

表1 菌株的染色鑒定結(jié)果

表2 菌株的生化鑒定結(jié)果

2.2 固氮酶活性

通過公式計(jì)算，菌株的固氮酶活性結(jié)果見表3。從表3結(jié)果可見，在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌體蛋白量基本上一致，從瘤胃液中分離到的6株菌株中，只有LY-1的固氮酶活性較高，其余5株都較低，從瘤胃殘?jiān)蟹蛛x到的4株菌株的固氮酶活性均較高。

表3 菌株的固氮酶活性

2.3 菌株的16S rDNA鑒定

1.0%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1，圖中顯示所有菌株的PCR產(chǎn)物均在1 000～2 000 bp之間出現(xiàn)純化的單一條帶，無其他雜帶，且條帶明亮，表明得到的基因量很多。

圖1 菌株的PCR產(chǎn)物的電泳

測序結(jié)果顯示：獲得的基因片段大小都在1 400 bp左右。以瘤胃液為來源的6株固氮菌中，有3株鮑氏不動(dòng)桿菌、1株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌、1株索諾拉沙漠芽孢桿菌、1株山羊葡萄球菌。以瘤胃殘?jiān)鼮閬碓吹?株固氮菌中，有2株索諾拉沙漠芽孢桿菌、1株乙酸鈣不動(dòng)桿菌新亞種、1株枝芽孢菌新亞種。根據(jù)結(jié)果來看，瘤胃液中的LY-5和LY-6為相同種屬的菌株，瘤胃液中的LY-3與瘤胃殘?jiān)械腖C-2和LC-4為相同種屬的菌株。對應(yīng)菌株最相似的種屬關(guān)系及相似度和菌株序列號(hào)，見表4。

3 討論

雖然反芻動(dòng)物瘤胃是一個(gè)有復(fù)雜的微生物區(qū)系的厭氧環(huán)境，但在瘤胃中也存在著一定數(shù)量的兼性厭氧菌（鞏慶亮等，2008；Fan等，2012），瘤胃微生物中的大多數(shù)是嚴(yán)格厭氧的，他們遇到氧氣會(huì)立刻被殺死，然而氧氣會(huì)隨著飼喂飼料、飲水等方式進(jìn)入瘤胃，進(jìn)入的氧氣會(huì)被兼性厭氧菌所消耗，從而使瘤胃內(nèi)保持為厭氧環(huán)境(Kamra，2005)。這些兼性厭氧菌雖然不是瘤胃內(nèi)數(shù)量最多和最主要的細(xì)菌，但它們確實(shí)在瘤胃內(nèi)起著一定的重要作用(Kato等，2004)。近些年，雖然有些學(xué)者對瘤胃的兼性厭氧菌做了一些研究，但對于瘤胃中兼性厭氧固氮菌的研究還相對較少。在本試驗(yàn)中，從荷斯坦奶牛的瘤胃液中和瘤胃殘?jiān)泄卜蛛x到了10株具有固氮酶活性的兼性厭氧菌株，并對其進(jìn)行了16S rDNA基因測序鑒定，進(jìn)一步證實(shí)了瘤胃內(nèi)兼性厭氧固氮菌的存在。

表4 菌株的種屬關(guān)系及相似度

測定固氮酶活性時(shí)，菌株的菌體蛋白量均在0.001 5～0.002 3 mg之間（見表3），保證了菌株量不對固氮酶活性產(chǎn)生影響。綜合分子鑒定的結(jié)果來看，從同一來源中分離到的同一種菌屬菌株（LY-5和LY-6；LC-2和LC-4）的固氮酶活性基本相同，而從不同來源中分離到的同一種菌屬的菌株（LY-3和LC-2、LC-4）的固氮酶活性則有所不同，表明固氮菌的固氮能力是會(huì)根據(jù)來源環(huán)境等條件的不同而變化，菌株的固氮能力相對的（王子芳，1982）。分離到的同一種菌屬菌株在瘤胃殘?jiān)械墓痰富钚愿哂诹鑫敢褐械?，這可能是因?yàn)榱鑫笟堅(jiān)鼇碓从谕饨?，進(jìn)入瘤胃時(shí)也會(huì)帶入一部分空氣，這種兼性厭氧菌會(huì)附著于殘?jiān)邢难鯕獠⑴c瘤胃發(fā)酵，使得酶活提高(Kato等，2004)；或者這種兼性厭氧菌本身就來源于外界，是隨著殘?jiān)M(jìn)入瘤胃的，一部分到了瘤胃液中，但其可能更適應(yīng)有氧條件，在有氧的環(huán)境中活動(dòng)更頻繁，活力更高，所以在無氧的瘤胃液中活性比較低。同時(shí)從分子鑒定的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，瘤胃液和瘤胃殘?jiān)卸挤蛛x到的菌株是索諾拉沙漠芽孢桿菌，其余的菌株都只在一種來源中被分離到，這可能是因?yàn)椴⒉皇撬械募嫘詤捬豕痰寄苌嬖诙喾N來源中，有的可能只生存在瘤胃液中，并不附著在殘?jiān)?，有的相反；或者可能是分離過程所致，有的菌株可能兩種來源都存在，沒有都被分離到；又或者可能是有的菌株只在一種來源中酶活很高，數(shù)量很多，而在另一來源中則相反，導(dǎo)致只在一種來源被分離到。

從瘤胃液和瘤胃殘?jiān)卸挤蛛x到了索諾拉沙漠芽孢桿菌。瘤胃中瘤胃液和瘤胃殘?jiān)浅浞只旌洗嬖诘?，而瘤胃殘?jiān)酁槿占Z飼料或舔舐草料時(shí)帶入的塵土。所以瘤胃內(nèi)的這種固氮菌有可能是從外界帶來的，這有待進(jìn)一步研究。根據(jù)李昊等（2013）的研究結(jié)果，結(jié)合本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兼性厭氧固氮菌和纖維菌混合添加比只有纖維菌的作用效果好，可能是因?yàn)樘砑拥墓痰鷷?huì)附著于飼料顆粒上，其活性高于瘤胃液中的，有利于飼料降解和瘤胃發(fā)酵。由于試驗(yàn)中的兼性厭氧固氮菌來源于瘤胃，其宿主適應(yīng)性和安全性能得到充分的保證，具有微生態(tài)制劑或飼用添加劑的開發(fā)價(jià)值（王炳曉等，2009）。

4 結(jié)論

分別從瘤胃液和瘤胃殘?jiān)鼉蓚€(gè)來源分離得到6株和4株兼性厭氧固氮菌；在相同來源中同一種屬的固氮菌酶活性基本相同，不同來源中同一種屬的固氮菌的固氮酶活性差異較大；兩個(gè)來源中分離到了同一菌屬的菌株，即索諾拉沙漠芽孢桿菌，相似度在99%以上。