■董 凱 徐丹丹 高迎迎 鄭輝杰 吳兆亮

(河北工業(yè)大學(xué)，天津 300130)

抗生素作為飼料添加劑應(yīng)用于動物生產(chǎn)中，對畜牧業(yè)的發(fā)展起到重要的作用。它通過對病原微生物的抑制和殺滅，減少動物的發(fā)病率[1-2]。但是，抗生素在動物體內(nèi)和動物產(chǎn)品中的殘留，以及對病原體產(chǎn)生抗藥性的問題，對人類健康和環(huán)境產(chǎn)生了影響[3]。

多粘菌素E（polymyxin E）又稱為粘菌素（colistion）[4-6]。多粘菌素E是多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）代謝產(chǎn)生的堿性多肽類抗生素[7]，分子結(jié)構(gòu)由一個七肽環(huán)狀結(jié)構(gòu)和一個多肽鏈組成[5]。多粘菌素E對革蘭氏陰性桿菌的抑菌作用顯著，尤其對綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）抑菌作用更佳[8-11]。多粘菌素E能與革蘭氏陰性菌的細(xì)胞膜上磷脂相結(jié)合，使細(xì)菌細(xì)胞膜面積擴(kuò)大，通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的磷酸鹽、核苷酸等成分外漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。多粘菌素E具有較好抗菌譜和高效、殘留少的特點[8]，常被用于飼料的添加劑，提高飼料利用率與促進(jìn)禽畜生長及防止大規(guī)模生產(chǎn)中出現(xiàn)的被沙門氏菌與大腸埃希氏菌污染所帶來的疾病[12-13]，由于耐藥菌株的不斷增加而新藥的研發(fā)緩慢，多粘菌素E的需求量越來越大[14]。

近年來，許多學(xué)者對多粘菌素E的發(fā)酵進(jìn)行了研究，賴濱霞[15]對多粘菌素E進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵工藝參數(shù)的研究并取得了一定進(jìn)展，但并沒有解除多粘菌素E的產(chǎn)物抑制。張達(dá)等[16]對發(fā)酵耦合泡沫分離多粘菌素E進(jìn)行了研究解除了產(chǎn)物抑制使產(chǎn)物量增加。但是在其研究工藝中大量的菌體以及營養(yǎng)物質(zhì)流失。

針對多粘菌素的產(chǎn)物抑制問題該文采用發(fā)酵耦合泡沫分離技術(shù)。對于防止菌體和營養(yǎng)物質(zhì)的流失，該文采用膜分離技術(shù)和分批補(bǔ)料技術(shù)相結(jié)合。本研究將發(fā)酵耦合泡沫分離技術(shù)與分批補(bǔ)料和膜分離技術(shù)相結(jié)合的一項綜合性發(fā)酵技術(shù)，擬解決菌體流失和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏以及產(chǎn)物抑制等問題。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

多粘類芽孢桿菌（B.polymyxa），原菌種來自河北圣雪大成有限公司，經(jīng)本實驗室選育優(yōu)化后用于該實驗的研究菌株（MX-210），由本實驗室收藏。葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸銨、硫酸亞鐵、硫酸多粘菌素E標(biāo)準(zhǔn)品（均為分析純）。乙腈為色譜純。以上試劑均購于北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗設(shè)備

一種自制玻璃發(fā)酵罐被設(shè)計用于多粘菌素E發(fā)酵耦合泡沫分離，如圖1所示。

圖1 綜合性發(fā)酵罐裝置

廣口瓶中裝有6 mol/l NaOH用于除去空氣中的二氧化碳和干燥空氣?？盏膹V口瓶防止液體回流。空氣濾菌體移除空氣中的菌體確保發(fā)酵液染菌。泡沫分離柱被裝入發(fā)酵罐(1.8 L)中，下部被打孔(直徑1 cm)并被纖維素膜覆蓋。氣泡分布器裝置與分離柱底部用于通氣產(chǎn)生泡沫進(jìn)行泡沫分離。

1.3 多粘菌素E檢測方法

多粘菌素E活性檢測采用高效液相色譜（Agilent HPLC 1100 ChemStation）。分離柱規(guī)格：C18,3.5 μm,4.6×160 mm。27.4%的乙腈溶液做流動相流速為1.0 ml/min。注射體積為20 μl并保持柱溫25℃。

1.4 培養(yǎng)基組分

種子培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖20、酵母粉20、氯化鈉1、磷酸二氫鉀0.5，pH值6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g/l）：葡萄糖20、蛋白胨21.05、硫酸銨16.25、氯化鈉1、硫酸亞鐵0.1、磷酸二氫鉀0.5，pH 值7。

1.5 試驗設(shè)計

500 ml的錐形瓶中添加100 ml種子液在搖床中培養(yǎng)21 h，條件為轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度33℃。種子發(fā)酵液接種到發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量為1 L。pH值通過氨水保持在5.5，溫度33℃。打開通氣閥1關(guān)閉通氣閥2，并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子流量計1的氣速穩(wěn)定在100 ml/min。每3 h取樣進(jìn)行檢測剩余葡糖糖含量、菌體含量、多粘菌素E的含量。

最佳補(bǔ)料時間和泡沫分離時間由上述實驗得到。在相同的條件下，發(fā)酵48 h，在確定的最佳泡沫分離時間打開通氣閥2使氣速穩(wěn)定在100 ml/min，選擇孔徑為0.22、0.30、0.45 μm的纖維素膜進(jìn)行試驗，得到最佳孔徑的纖維素膜。

在最佳膜孔徑的條件下調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)子流量計2使其氣速分別為40、60、80、100、120和140 ml/min進(jìn)行試驗。在優(yōu)化后的氣速條件下進(jìn)行補(bǔ)料體積為50、100、150、200、250、300 ml進(jìn)行試驗得到最佳補(bǔ)料體積。然后進(jìn)行補(bǔ)料濃度的試驗。

上述所有試驗均重復(fù)進(jìn)行3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

多粘菌素E的總效價（T）等于消泡液的總效價與發(fā)酵液總效價之和，表達(dá)式如下：

式中：Tf和Tb分別為消泡液的效價和發(fā)酵液的效價；Vf和Vb分別表示消泡液體積和發(fā)酵液體積。

2 結(jié)果與討論

2.1 多粘類芽孢桿菌的發(fā)酵曲線

多粘類芽孢桿菌的細(xì)胞代謝通常伴隨著細(xì)胞生長而變化，因此有必要獲得最大的菌株濃度確保多粘菌素E產(chǎn)量最大化。該試驗在多粘類芽孢桿菌被接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中48 h內(nèi)檢測多粘菌素E的含量及菌體濃度變化。結(jié)果如圖2所示。

圖2 多粘類芽孢桿菌發(fā)酵過程

從圖2中可以看出，多粘菌素E含量增長迅速隨著菌體的增長及葡萄糖的消耗，發(fā)酵33 h時多粘菌素E濃度最大。然而，當(dāng)菌體含量進(jìn)入穩(wěn)定狀態(tài)和葡萄糖消耗殆盡時，多粘菌素E的含量幾乎不在增加。主要因為多粘菌素E的產(chǎn)物抑制和發(fā)酵液中碳源的缺乏。為了獲得最大的產(chǎn)量，在發(fā)酵33 h后進(jìn)行泡沫分離解除產(chǎn)物抑制和補(bǔ)充碳源十分必要。

2.2 纖維素膜對菌體生長的影響

多粘菌素E的產(chǎn)量直接與多粘類芽孢桿菌含量相關(guān)。所以，研究膜對菌體生長的影響十分重要。分別進(jìn)行兩組試驗，一組泡沫分離柱運(yùn)用膜，另一組分離柱沒有膜，進(jìn)行發(fā)酵耦合泡沫分離試驗，結(jié)果如圖3所示。

圖3 膜組件對菌體生長的影響

兩組試驗在發(fā)酵33 h時，打開通氣閥2進(jìn)行泡沫分離。由圖3可以看出，在前33 h菌體增長趨勢幾乎相同，但在進(jìn)行泡沫分離后菌體含量明顯不同。因為纖維素膜的孔徑比菌體體積小，菌體不能通過纖維素膜進(jìn)入泡沫分離柱，這樣就阻止了菌體的流失。相反，多粘菌素E的發(fā)酵液卻能通過纖維素膜進(jìn)入分離柱，從而解除產(chǎn)物抑制。而沒有膜的一組試驗，因為沒能阻止菌體隨泡沫流失，致使發(fā)酵罐內(nèi)菌體含量降低。

2.3 膜孔徑對多粘菌素E發(fā)酵的影響

在發(fā)酵33 h時通氣進(jìn)行泡沫分離，纖維素膜將阻止菌體隨著泡沫被帶出而造成菌體流失同時解除產(chǎn)物抑制。然而膜孔徑的大小將直接影響發(fā)酵液的通透率，進(jìn)而影響產(chǎn)物濃度。因此對膜孔徑的探究對提高產(chǎn)物產(chǎn)量十分重要。在泡沫分離過程中，才用不同孔徑的膜進(jìn)行試驗，所得到數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 膜孔徑對消泡液體積和效價的影響

從表1可知，消泡液的體積隨著膜孔徑的增加而增加。膜孔徑越大對發(fā)酵液透過膜進(jìn)入分離柱的阻力越小，因此消泡液的體積增加。此外，隨著阻力的減小多粘菌素E能夠及時的進(jìn)入分離柱內(nèi)，這使得消泡液內(nèi)的多粘菌素E的含量增加。當(dāng)多粘菌素E被分離出越多，發(fā)酵液內(nèi)的含量越低。不同膜孔徑下，多粘菌素E的總含量不同。在孔徑為0.45 μm時，多粘菌素E的效價達(dá)到3.09×106U/l。所以，孔徑為0.45 μm的纖維素膜被用于后續(xù)試驗。

2.4 分離柱內(nèi)氣速對多粘菌素E發(fā)酵的影響

在發(fā)酵33 h時打開通氣閥2的目的是為了分離多粘菌素E從而解除產(chǎn)物抑制，增加產(chǎn)物總量。在解除產(chǎn)物抑制的同時發(fā)酵液內(nèi)的多粘菌素E的含量會發(fā)生變化。通氣速率的不同引起發(fā)酵液內(nèi)多粘菌素E含量的變化如圖4所示。

由圖4可知，發(fā)酵液內(nèi)多粘菌素E含量出現(xiàn)先減小后增加的趨勢。因為在泡沫分離時大量的多粘菌素E被分離出，導(dǎo)致發(fā)酵液內(nèi)多粘菌素E的含量降低。同時也因此解除產(chǎn)物抑制使菌體再次合成多粘菌素E使之呈現(xiàn)再次上升趨勢。通氣速率的不同直接影響發(fā)酵液的氣泡速率，進(jìn)而導(dǎo)致多粘菌素E被分離速率不同。因此造成發(fā)酵液內(nèi)剩余的多粘菌素E的含量不同。

圖4 通氣速率對發(fā)酵液效價的影響

通氣速率不僅影響消泡液的體積，而且對消泡液內(nèi)多粘菌素E的濃度也有很大影響。產(chǎn)物濃度在工業(yè)發(fā)酵后期純化過程中占有重要地位。產(chǎn)物濃度高可以減少后期純化過程和減少能耗。因此通氣速率和消泡液產(chǎn)物濃度之間的關(guān)系研究十分必要。分離柱內(nèi)的通氣速率對消泡液產(chǎn)物濃度的影響如圖5所示。

圖5 通氣速率對消泡液效價的影響

由圖5可以看出，隨著通氣速率的增大消泡液內(nèi)產(chǎn)物濃度逐漸減小。這是由于當(dāng)通氣速率增加時，分離柱內(nèi)的起泡性增加更容易形成泡沫，泡沫上升速度提高從而泡沫在分離柱內(nèi)的停留時間減短。當(dāng)泡沫的停留時間減短后，泡沫的排液時間下降導(dǎo)致泡沫持液量增加。所以消泡液內(nèi)的多粘菌素E的含量降低。但消泡液的體積卻增加。

多粘菌素E的總產(chǎn)量與消泡液、發(fā)酵液的體積及產(chǎn)物含量直接相關(guān)。分離柱內(nèi)通氣量對多粘菌素E的總效價的影響如圖6所示。

圖6 通氣速率對產(chǎn)物總效價的影響

由圖6所示，分離柱內(nèi)通氣速率增加時，產(chǎn)物總效價呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。分離柱內(nèi)通氣速率增加時，消泡液體積增加但產(chǎn)物濃度降低。導(dǎo)致發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液體積和產(chǎn)物濃度降低。盡管在通氣速率低時，多粘菌素E的含量高，但是消泡液體積小。根據(jù)總效價與發(fā)酵液和消泡液之間的關(guān)系，可以得到最佳通氣速率使多粘菌素E的總效價最大。如圖6所示，當(dāng)分離柱內(nèi)通氣速率為80 ml/min時，多粘菌素E的總效價最高。

2.5 補(bǔ)料體積對發(fā)酵的影響

隨著泡沫分離的進(jìn)行，雖然解除了產(chǎn)物抑制和阻止了菌體流失但同時也造成了營養(yǎng)物質(zhì)的流失。為了最大化的獲取多粘菌素E，當(dāng)發(fā)酵33 h時最初的葡萄糖被消耗完，補(bǔ)料液被添加。補(bǔ)料液的濃度與發(fā)酵培養(yǎng)基濃度相同。不同的補(bǔ)料液體積被研究，發(fā)酵結(jié)果如圖7所示。

隨著補(bǔ)料液體積的增加，多粘菌素E的總效價呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。因為隨著補(bǔ)料液體積的逐步增加，發(fā)酵液中所缺乏的碳源及營養(yǎng)物質(zhì)被補(bǔ)充。能夠為多粘菌素E的合成提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，所以多粘菌素E的總效價增加。但是菌體含量是影響代謝合成多粘菌素E的一個重要因素。當(dāng)補(bǔ)料體積過大時，造成發(fā)酵液中菌體含量降低到一定值時，菌體生長的抑制被減弱從而再次出現(xiàn)菌體增長以至于多粘菌素E的合成率降低。所以，當(dāng)補(bǔ)料體積為150 ml時，多粘菌素E的總效價達(dá)到最高，為3.37×107U/l。

圖7 補(bǔ)料液體積對產(chǎn)品總效價的影響

2.6 補(bǔ)料濃度對多粘菌素E發(fā)酵的影響

在進(jìn)行泡沫分離的過程中，除了多粘菌素E被帶出營養(yǎng)物質(zhì)也隨著泡沫被帶出。為了確定營養(yǎng)物質(zhì)被帶出的成分，從而添加該營養(yǎng)物質(zhì)。蛋白胨、葡萄糖、多粘菌素E的氣泡性能被檢測在泡沫分析儀DFA100。各物質(zhì)的泡沫高度和泡沫半衰期如圖8所示。

圖8 物質(zhì)的起泡性和穩(wěn)定性

結(jié)果說明三者的氣泡能力為：多粘菌素E＞蛋白胨＞葡萄糖。而泡沫穩(wěn)定性為：蛋白胨＞多粘菌素E＞葡萄糖。因為蛋白胨和多粘菌素E是多肽類物質(zhì)含有親水性基團(tuán)和疏水性基團(tuán)是表面活性物質(zhì)。而葡萄糖是不含有表面活性的小分子物質(zhì)。因此消泡液中含有大量的多粘菌素E和蛋白胨卻還有少量葡萄糖。

在分離柱內(nèi)進(jìn)行泡沫分離解除產(chǎn)物抑制的同時大量的蛋白胨也隨著泡沫被帶出，造成氮源的流失。因此，碳、氮比率失衡直接影響細(xì)菌的新陳代謝。所以，應(yīng)在補(bǔ)料液中添加更多的蛋白胨以補(bǔ)充氮源。在發(fā)酵33 h時添加補(bǔ)料液，補(bǔ)料液中蛋白胨濃度從20 g/l增加到50 g/l，結(jié)果如圖9所示。

圖9 蛋白胨濃度對產(chǎn)物總效價的影響

隨著蛋白胨濃度的增加，多粘類芽孢桿菌代謝和多粘菌素E所需的氮源被及時補(bǔ)充，所以多粘菌素E的總效價增加。當(dāng)?shù)鞍纂说臐舛仍黾拥揭欢ㄖ禃r多粘菌素E的總效價不再增加。這是由于發(fā)酵液中其他營養(yǎng)物質(zhì)的限制造成了蛋白胨的過剩。所以蛋白胨濃度再增加，而多粘菌素E的總效價呈現(xiàn)平衡狀態(tài)。由圖9所知，當(dāng)補(bǔ)料液中蛋白胨濃度為35 g/l時，多粘菌素E的總效價達(dá)到最高，為3.49×107U/l。

3 結(jié)論

該試驗結(jié)果表明，將膜分離和分批補(bǔ)料技術(shù)與發(fā)酵耦合泡沫分離技術(shù)相結(jié)合運(yùn)用于飼料添加劑多粘菌素E的發(fā)酵工藝中，能顯著提高多粘菌素E的產(chǎn)量。通過對發(fā)酵工藝的改進(jìn)試驗得到最佳的操作參數(shù)以補(bǔ)料濃度為：纖維素膜的孔徑為0.45 μm、分離柱內(nèi)的通氣速率為80 ml/min、發(fā)酵33 h開始泡沫分離和補(bǔ)料操作、補(bǔ)料液體積150 ml、補(bǔ)料液蛋白胨濃度35 g/l。發(fā)酵48 h多粘菌素E的總效價達(dá)到3.49×107U/l相比優(yōu)化前（2.51×107U/l）提高了39%。