■ 鄧永平 艾瑞波 郭建華 劉曉蘭 鄭喜群 宮 曉 殷 景

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省普通高校齊齊哈爾農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾 161006)

飼用復(fù)合酶是一類新型的活性飼料添加劑，在畜禽日糧中添加一定比例的復(fù)合酶能明顯提高飼料的消化率和轉(zhuǎn)化率，降低料肉比，縮短生長周期；同時(shí)還有防病和減少環(huán)境污染的作用，無任何毒、副作用，被譽(yù)為真正的綠色飼料添加劑[1-2]。同時(shí)，開發(fā)酶制劑、微生物制劑等新型飼料添加劑也是我國飼料工業(yè)“十三五”期間的主要任務(wù)之一。

微生物發(fā)酵是制備飼用酶的主要途徑，已有報(bào)道在 Mucor indicusMTCC 6333、Aspergillus japonicus、Trichoderma reesei、Aspergillus nigerAS3.3928、Aspergillus aculeatus、Rhizopus chinesis的代謝產(chǎn)物中存在不同酶組成的復(fù)合酶[3-8]。為了充分發(fā)揮微生物的產(chǎn)酶優(yōu)勢，以及加強(qiáng)對(duì)各種糟渣的利用，學(xué)者們近些年還開展了混菌發(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶的工作[9-10]。

現(xiàn)有的報(bào)道主要集中于飼用復(fù)合酶發(fā)酵條件及應(yīng)用的研究，鮮見對(duì)酶的提取的研究，而酶活力的高低不僅與發(fā)酵條件有關(guān)，在提取過程中酶的活力也會(huì)有不同程度的損失，因此，探索復(fù)合酶適宜的提取條件是非常必要的。根霉是發(fā)酵工業(yè)中常用的生產(chǎn)菌種，能分泌多種酶系。本文所采用的菌株中華根霉12#來源于南方小酒藥，此菌安全性較高，且經(jīng)過發(fā)酵能產(chǎn)生多種酶系，是一種較理想的生產(chǎn)飼用復(fù)合酶的菌株。本文研究了中華根霉12#產(chǎn)飼用復(fù)合酶的浸提條件和體外對(duì)飼料的降解情況，以期為開發(fā)該復(fù)合酶為“綠色飼料添加劑”奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1 菌種

中華根酶12#（Rhizopus Chinesis12#）。

1.2 試劑及材料

木聚糖、果膠、D-半乳糖醛酸均購自Sigma公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑；CF15RXII高速冷凍離心機(jī)（Hitachi）、高速萬能粉碎機(jī)FW80（天津市泰斯特儀器有限公司）、分光光度計(jì)TU-1810（北京普析通用儀器有限公司）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

①斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。將菌種接入PDA培養(yǎng)基后于28～30℃培養(yǎng)4～5 d，轉(zhuǎn)入4℃條件下保存，備用。

②固體發(fā)酵培養(yǎng)基：250 ml三角瓶中裝6 g麩皮和4 g豆渣，培養(yǎng)基料水比為1∶2，pH值自然，接種量為103個(gè)孢子/g干基，28～30 ℃條件下培養(yǎng)96 h[8]。

2.2 酶活力的測定

①淀粉酶的活力測定：采用DNS法。底物為1%淀粉溶液。酶活力定義：在40℃、pH值6.0的條件下，1 min水解淀粉生成1 μg葡萄糖所需要的酶量，規(guī)定為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

②果膠酶活力測定：采用DNS法。底物為0.4%果膠溶液。酶活力定義：在45℃、pH值6.0的條件下，1 min分解果膠生成1 μg半乳糖醛酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

③纖維素酶活力測定：采用DNS法。底物為1%羧甲基纖維素鈉溶液。酶活力定義：在45℃、pH值6.0的條件下，1 min分解羧甲基纖維素鈉生成1 μg同葡萄糖的還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

④ 木聚糖酶活力測定：采用DNS法。底物為0.4%木聚糖溶液。酶活力定義：在45℃、pH值6.0的條件下，1 min分解木聚糖生成1 μg還原糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

⑤蛋白酶活力測定：底物為1%酪蛋白溶液（pH值6.0）。酶活力定義：在40℃ pH值6.0條件下，1 h水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg酪氨酸所需的酶量，規(guī)定為1個(gè)酶活力單位，以U/g表示。

2.3 浸提溶劑的確定

分別將100 ml的2%CaCl2溶液、自來水、生理鹽水加入固體發(fā)酵產(chǎn)物中，在30℃、120 r/min條件下振蕩浸提酶4 h，10 000 r/min離心10 min，測上清液中酶活力。

2.4 浸提溫度的確定

向培養(yǎng)物中加入100 ml浸提溶劑，分別在25、30、40、50 ℃條件下150 r/min振蕩浸提酶4 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定不同浸提溫度下的酶活力。

2.5 浸提時(shí)間的確定

向發(fā)酵后的培養(yǎng)物中加入100 ml浸提溶劑，在30 ℃搖床中150 r/min振蕩浸提酶，在1、2、3、4、5、6 h時(shí)，10 000 r/min離心10 min，測上清液中酶活力。

2.6 搖床轉(zhuǎn)速的確定

采用上述試驗(yàn)確定的條件分別在90、120、150、180、210 r/min條件下提取酶，10 000 r/min離心10 min，測上清液中酶活力。

2.7 粗酶液對(duì)豆粕的降解

稱取10 g豆粕粉(過80目篩)，加入到250 ml三角瓶中，分別加入料酶體積比為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的復(fù)合酶液，并用生理鹽水補(bǔ)至100 ml，反應(yīng)體系最終pH值為6.0，對(duì)照組加100 ml生理鹽水；在40℃恒溫水浴鍋中酶解2、4、6、8、10 h，每2 h取樣測還原糖含量。

2.8 粗酶液對(duì)玉米粉的降解

稱取10 g玉米粉（過80目篩）于250 ml三角瓶中，分別加入料酶體積比為1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5的復(fù)合酶液，并用生理鹽水補(bǔ)至100 ml，反應(yīng)體系最終pH值為6.0，對(duì)照組加100 ml生理鹽水；在40℃恒溫水浴鍋中振蕩（150 r/min）酶解2、4、6、8、10 h，每2 h取樣測還原糖含量。

2.9 還原糖測定

采用DNS法測定復(fù)合酶液降解植物性飼料生成的還原糖量。吸取1 ml樣液，置于25 ml比色管中，再加入DNS試劑1.5 ml，沸水顯色5 min，然后用流水迅速冷卻，用蒸餾水定容至20 ml，用振蕩器搖勻。以蒸餾水空白調(diào)零，在540 nm處比色，參照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求出還原糖的含量。

還原糖得率(%)=還原糖含量(mg)×稀釋倍數(shù)×100/樣品干重(g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 浸提條件對(duì)酶活力的影響

3.1.1 浸提溶劑的確定

向發(fā)酵產(chǎn)物中分別加入100 ml自來水、生理鹽水、2%氯化鈣溶液浸提酶，對(duì)浸提產(chǎn)物冷凍離心，取上清液測定酶活力，確定不同溶劑的浸提效果，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 浸提溶劑對(duì)酶活力的影響

由圖1可知，發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)自來水浸提所得的五種酶活力都較低，氯化鈣居中，生理鹽水浸提后的酶活力較高。同時(shí)，考慮到復(fù)合酶浸提時(shí)保護(hù)酶的活力及成本，所以選擇生理鹽水作為下一步的浸提溶劑。

3.1.2 浸提溫度的確定

溫度對(duì)酶活力有顯著影響，溫度升高分子運(yùn)動(dòng)速度加快，有利于縮短酶的浸提時(shí)間，但是溫度過高，易導(dǎo)致不耐熱酶的活力降低，甚至失活，直接影響酶的進(jìn)一步研究與應(yīng)用。試驗(yàn)采用上一步確定的生理鹽水為浸提溶劑，振蕩浸提4 h，浸提溫度分別為25、30、40、50 ℃，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

由圖2可知，浸提溫度40℃時(shí)，除蛋白酶外，其它各種酶活力都相對(duì)較高，分別是木聚糖酶活力124 U/g、果膠酶活力46 U/g、纖維素酶活力64 U/g、淀粉酶活力875 U/g，綜合考慮，浸提溫度選擇40℃。

圖2 不同浸提溫度對(duì)酶活力的影響

3.1.3 浸提時(shí)間的確定

發(fā)酵液的浸提時(shí)間如過長，不僅易染菌，導(dǎo)致酶活力的降低，而且使生產(chǎn)周期延長；浸提時(shí)間過短，目標(biāo)酶浸提不完全，不能達(dá)到最好的浸提效果。用生理鹽水對(duì)中華根霉12#固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行浸提，在其他條件不變的情況下，對(duì)浸提時(shí)間對(duì)粗酶液酶活力的影響進(jìn)行研究。試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同浸提時(shí)間對(duì)酶活力的影響

從圖3可見，浸提時(shí)間4 h時(shí)，除果膠酶外，其它各種酶活力都相對(duì)較高，分別為木聚糖酶活98 U/g、纖維素酶活71 U/g、淀粉酶活854 U/g、蛋白酶活653 U/g，綜合考慮，浸提時(shí)間選擇4 h。

3.1.4 搖床轉(zhuǎn)速的確定

通過往復(fù)式搖床振蕩浸提有利于酶與浸提溶劑的充分接觸，縮短浸提時(shí)間，但是需要控制合適的搖床轉(zhuǎn)速，既能將酶最大程度的浸提出來，又不能因?yàn)檗D(zhuǎn)速過快使局部熱量過高導(dǎo)致酶失活。試驗(yàn)選擇了90、120、150、180、210 r/min條件下提取酶，結(jié)果如圖4所示。

圖4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)酶活力的影響

由圖4可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min時(shí)，五種酶的活力均較高，因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

3.2 粗酶液對(duì)飼料原料中還原糖的降解

體外酶解試驗(yàn)中還原糖含量是可以直觀反映酶制劑分解某種底物能力大小的一個(gè)重要指標(biāo)[11]。以產(chǎn)生的同葡萄糖的還原糖為指標(biāo)，研究中華根霉12#固體發(fā)酵生產(chǎn)的復(fù)合酶對(duì)豆粕粉和玉米粉兩種飼料原料的降解情況。經(jīng)測定，本次試驗(yàn)復(fù)合酶中各種酶活力分別是：木聚糖酶活力113 U/g、果膠酶活力48 U/g、纖維素酶活力79 U/g、淀粉酶活力812 U/g、蛋白酶活力589 U/g。

復(fù)合酶對(duì)豆粕粉的降解情況見圖5。

圖5 不同酶解條件對(duì)豆粕中還原糖量的影響

從圖5可以看出，不同酶用量條件下的酶解得到的還原糖產(chǎn)量均明顯高于對(duì)照組。隨著酶用量的逐漸增加，還原糖產(chǎn)量逐漸增加，但是隨著酶用量的進(jìn)一步提高，還原糖的產(chǎn)量反而下降，料酶比為1∶4反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)還原糖產(chǎn)量達(dá)到最高。

鑒于酶解豆粕試驗(yàn)中高濃度的復(fù)合酶并沒有增加還原糖的得率，所以，該試驗(yàn)提高了料酶比，復(fù)合酶對(duì)玉米粉的降解情況見圖6。

圖6 不同酶解條件對(duì)玉米粉中還原糖量的影響

從圖6中可以看出，不同酶用量條件下的還原糖得率差異不大，但是均高于對(duì)照。綜合考慮到飼料加工、產(chǎn)物濃縮以及能耗等諸多因素(有關(guān)飼用復(fù)合酶酶解條件的研究仍在進(jìn)行中，隨后會(huì)有相關(guān)后續(xù)報(bào)導(dǎo))，故確定料酶比為1∶1，降解時(shí)間為6 h。

與文獻(xiàn)報(bào)道相比，本文中復(fù)合酶酶解豆粕粉和玉米粉的還原糖得率高峰期都提前了[12]。這提示不同來源的復(fù)合酶在降解植物性飼料時(shí)，有諸多影響因素，如酶的用量、作用時(shí)間、飼料底物種類、作用pH值和溫度等都會(huì)影響到最終的飼料的消化利用情況，需要具體分析，從而達(dá)到充分發(fā)揮飼用酶制劑的作用，提高飼料利用率，降低養(yǎng)殖成本的目的。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)以中華根霉12#為生產(chǎn)菌種，利用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)飼用復(fù)合酶，對(duì)酶的浸提條件和體外對(duì)植物性飼料原料的降解情況進(jìn)行了探討。試驗(yàn)結(jié)果表明:提取溶劑為生理鹽水，浸提時(shí)間為4 h，浸提溫度為40℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min。在40℃條件下，豆粕粉與復(fù)合酶液比例為1∶4酶解4 h時(shí)生成還原糖量最高；玉米粉與復(fù)合酶液比例為1∶1酶解6 h時(shí)生成還原糖量最高。