■張婷婷 陳效儒 梁萌青 鄭珂珂 徐后國(guó) 陳齊勇

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東青島266071；2.通威股份有限公司，四川成都610063；3.大連海洋大學(xué)，遼寧大連116021)

水產(chǎn)飼料長(zhǎng)期以來(lái)依賴(lài)魚(yú)粉為主要優(yōu)質(zhì)蛋白源，但隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的擴(kuò)大與發(fā)展，魚(yú)粉的需求量急劇上升，導(dǎo)致魚(yú)粉的價(jià)格不斷攀升，單純依靠魚(yú)粉為飼料蛋白源已經(jīng)難以滿(mǎn)足水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展要求[1-2]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究表明，蛋白水解物在酶解和加熱處理過(guò)程中能夠消除大部分植物蛋白源中抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)蛋白水解物通過(guò)水解后脂肪含量、灰分含量很低，且富含低分子小肽和游離氨基酸，目前已經(jīng)成為解決魚(yú)粉短缺問(wèn)題的一個(gè)重要途徑[3-6]。魚(yú)蛋白水解物含有豐富的生物活性肽和游離氨基酸，并且具有促進(jìn)生長(zhǎng)、提高抗氧化性、增強(qiáng)免疫力等生理功能[7-8]，魚(yú)蛋白水解物可增強(qiáng)花鱸(Lateolabrax japonicus)的非特異性免疫[9]；豬血蛋白水解物是一種具備保健功能、經(jīng)濟(jì)效益高、游離氨基酸含量高的氨基酸營(yíng)養(yǎng)液[10]，將新鮮豬血徹底水解后，產(chǎn)物是一種對(duì)機(jī)體具有免疫增強(qiáng)活性且長(zhǎng)度不等的小肽混合物[11]；豆粕經(jīng)酶水解可去除其中大部分抗?fàn)I養(yǎng)因子、可溶性碳水化合物和粗纖維等[3]，大豆蛋白水解物可提高仔豬的生長(zhǎng)性能、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化率及免疫功能[3]；酵母水解物富含小肽、游離氨基酸、核苷酸及豐富的B族維生素[12]，飼料中添加酵母水解物可提高大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼魚(yú)非特異性免疫能力[13]。

本研究以凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)為對(duì)象，研究飼料中分別以魚(yú)蛋白水解物(Fish protein hydrolysate，F(xiàn)PH)、豬血蛋白水解物(Pig blood protein hydrolysate，PBPH)、豆粕蛋白水解物(Soybean protein hydrolysate，SPH)、酵母蛋白水解物(Yeast protein hydrolysate ，YPH)替代魚(yú)粉(Fish meal,FM)，對(duì)其生長(zhǎng)性能、飼料利用、體組成成分及非特異性免疫的影響，為蛋白水解物在對(duì)蝦飼料中的應(yīng)用提供技術(shù)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蛋白水解物的制備

以鱈魚(yú)排、豬血粉、豆粕粉、啤酒酵母粉為原料，參考Zheng等(2012)的方法，采用酶解技術(shù)，利用風(fēng)味蛋白酶(Flavourzyme)和堿性蛋白酶(Alcalase)聯(lián)合水解，然后冷凍干燥得到四種蛋白水解物，分別為魚(yú)蛋白水解物(Fish protein hydrolysate，F(xiàn)PH)、豬血蛋白水解物(Pig blood protein hydrolysate，PBPH)、大豆蛋白水解物(Soybean protein hydrolysate，SPH)和酵母蛋白水解物(Yeast protein hydrolysate，YPH)。置于-20 ℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)飼料

實(shí)驗(yàn)以魚(yú)粉和豆粕為主要蛋白源，魚(yú)油為主要脂肪源，對(duì)照組(FM組)魚(yú)粉含量為25%，實(shí)驗(yàn)組分別以魚(yú)蛋白水解物、豬血蛋白水解物、豆粕蛋白水解物、酵母蛋白水解物替代10%的魚(yú)粉蛋白，記作FPH組、PBPH、SPH和YPH組，配置成5組等氮、等脂的配合飼料，實(shí)驗(yàn)飼料原料均粉碎過(guò)80目篩后，加工制成直徑為1.2 mm的5種等氮、等脂的配合飼料，55℃烘飼料至水分5%～10%，置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆茫暳吓浞胶蜖I(yíng)養(yǎng)水平如表1所示，飼料氨基酸組成見(jiàn)表2。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所鰲山衛(wèi)養(yǎng)殖基地進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，暫養(yǎng)兩周使其適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，停食24 h，選擇大小均勻、健康且體表無(wú)病的凡納濱對(duì)蝦(2.39±0.10)g，隨機(jī)將蝦分于15個(gè)養(yǎng)殖桶(水體體積120 L)內(nèi)，每桶20尾。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中按對(duì)蝦體重的5%～10%進(jìn)行投喂，然后根據(jù)每天各桶的攝食情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，每天投喂4次，投喂時(shí)間為7：30、12：00、16：00和21：00，各時(shí)間點(diǎn)投喂量占日總投量的比例分別為30%、20%、30%、20%。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行68 d，飼養(yǎng)期間連續(xù)充氣，每日換水1次，日換水量為桶內(nèi)水量的1/3，水溫27～30℃，鹽度30左右，pH 值為7.2～7.5，溶解氧含量在7 mg/l左右，氨氮低于0.5 mg/l。

表1 飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平(%)

1.4 樣品采集

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，取12尾對(duì)蝦用于體成分分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，停食24 h，稱(chēng)重并記錄尾數(shù)，然后每桶中隨機(jī)選取5尾對(duì)蝦，保存于-20℃冰箱中，用于全蝦體成分分析；每桶再另取10尾蝦，用1 ml無(wú)菌注射器從對(duì)蝦頭胸甲后緣圍心竇入針取血，注入1.5 ml離心管中，置于4℃冰箱中靜置24 h后10 000 r/min離心，取上清液保存于-80℃冰箱中備用；采血后剝?nèi)ジ我认?，將取出的肝胰腺放?.5 ml離心管中，置于-80℃低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 測(cè)定指標(biāo)

1.5.1 體成分分析

蛋白水解物、飼料和全蝦樣品在105℃烘干至恒重，通過(guò)失重法測(cè)定干物質(zhì)含量，然后進(jìn)行生化測(cè)定。粗蛋白采用凱式定氮法(凱氏定氮儀，意大利，VELP UDK142)測(cè)得；粗脂肪采用索氏提取法(索氏抽提儀，丹麥，SOXTECTM2050)測(cè)得，以石油醚作為抽提液；灰分測(cè)定先將樣品炭化至無(wú)煙，然后放入馬福爐中550℃燃燒16 h，失重法測(cè)定灰分含量；蛋白水解物、飼料中氨基酸的含量測(cè)定，樣品均經(jīng)冷凍干燥(冷凍干燥機(jī)，日本，F(xiàn)DU-1100)24 h后，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀(日本，日立L-8900型)測(cè)得。

表2 實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸組成(%干物質(zhì))

1.5.2 血清和肝胰臟非特異性免疫相關(guān)酶活性的測(cè)定

從-80℃超低溫冰箱中取出肝胰臟樣品，轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中，待其解凍后備用。準(zhǔn)確稱(chēng)量肝胰臟0.5 g，然后按1∶10的質(zhì)量體積比加入預(yù)冷的生理鹽水，在冰浴條件下，用勻漿器勻漿，將勻漿液在4℃下3 000 r/min離心10 min所得上清液即為粗酶液，并于24 h內(nèi)測(cè)定。血清和肝胰臟中的酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮合酶(NOS)活性和肝臟蛋白濃度均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒(酶標(biāo)儀，瑞士，Tecan Infinite M200)檢測(cè)，總抗氧化能力(T-AOC)、過(guò)氧化物酶(POD)和溶菌酶(LZM)活性采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.5.3 計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析方法

對(duì)蝦的存活率、增重率、特定生長(zhǎng)率、攝食率、飼料效率、蛋白效率比、蛋白質(zhì)沉積率參考以下公式：

式中：N0、Nt——分別為初始和死亡的對(duì)蝦尾數(shù)；

W、W0、Wt——分別為每尾蝦攝食的飼料干物質(zhì)重(g)、實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)對(duì)蝦的體重(g)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)蝦的體重(g)；

P、P0、Pt——分別表示飼料粗蛋白含量(干重%)、實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)蝦體粗蛋白含量(濕重%)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)蝦體粗蛋白含量(濕重%)；

t——養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d)。

各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)，均采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，若差異顯著進(jìn)行鄧肯氏多重比較(Duncan's multiple range tests)，P＜0.05被認(rèn)為差異顯著，所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和飼料利用的影響（見(jiàn)表3）

表3 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和飼料利用的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

由表3可知，各處理組實(shí)驗(yàn)魚(yú)存活率為93.33%～96.67%之間，沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)；FPH組和FM組的末重和特定生長(zhǎng)率最高，兩組之間沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，但顯著高于PBPH組、SPH組和YPH組(P＜0.05)；FPH組和FM組的攝食率顯著低于PBPH組和SPH組(P＜0.05)，但與 YPH組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；飼料效率和蛋白效率比在各處理間的趨勢(shì)相同，即在FPH組與FM組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)，但與YPH組無(wú)顯著差異 (P＞0.05)；FPH組、FM組和YPH組的蛋白質(zhì)沉積率沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，但FPH組與FM組顯著高于SPH組(P＜0.05)。

2.2 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦體組成的影響（見(jiàn)表4）

表4 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦體組成的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)(%)

由表4可知，凡納濱對(duì)蝦蝦體干物質(zhì)含量范圍在22.26%～22.83%之間，粗蛋白含量范圍在78.73%～80.74%之間，粗脂肪含量范圍在3.55%～3.77%之間，灰分含量范圍在11.63%～13.04%之間。各處理組蝦體中干物質(zhì)和灰分含量沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)；FPH組、FM組、YPH組和PBPH組的粗蛋白含量沒(méi)有顯著差異(P＞0.05)，但FM組顯著高于SPH組(P＜0.05)；FPH組和FM組粗脂肪含量顯著高于YPH組和SPH組(P＜0.05)，但FPH組與PBPH組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰臟非特異性免疫的影響（見(jiàn)表5）

由表5可知，在血清中，堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和一氧化氮合酶活性FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；超氧化物歧化酶和過(guò)氧化物酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；溶菌酶FPH組和YPH組高于FM組，但沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)；總抗氧化能力FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)。在肝胰臟中，堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)；酸性磷酸酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；溶菌酶活性FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH和SPH組(P＜0.05)；總抗氧化能力FPH組顯著高于FM組(P＜0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于SPH組(P＜0.05)；過(guò)氧化物酶活性FPH組和YPH組高于FM組，但沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)，F(xiàn)PH組和YPH組顯著高于PBPH組和SPH組(P＜0.05)。

表5 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰臟中免疫相關(guān)酶活性的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)

3 討論

3.1 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和飼料利用的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在生長(zhǎng)方面，添加魚(yú)蛋白水解物的FPH組末期均重和特定生長(zhǎng)率與以魚(yú)粉為唯一蛋白源的FM組無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，添加PBPH、SPH和YPH組的末期均重和特定生長(zhǎng)率顯著低于FM組(P＜0.05)；在飼料利用方面，添加魚(yú)蛋白水解物的FPH組和添加酵母蛋白水解物的YPH組與FM組在攝食率、飼料效率、蛋白效率比和蛋白質(zhì)沉積率方面均沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。研究發(fā)現(xiàn)，相比YPH和PBPH，F(xiàn)PH更有利于金頭鯛(Sparus aurata)和歐洲鱸魚(yú)(Dicentrarchus labrax)幼魚(yú)的生長(zhǎng)[4-5]，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是基本一致，添加魚(yú)蛋白水解物和酵母蛋白水解物組的飼料利用效果要優(yōu)于添加豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物組。Gisbert等(2012)指出，酵母蛋白水解物和豬血蛋白水解物有可能替代魚(yú)蛋白水解物來(lái)制作海洋仔稚魚(yú)飼料[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，豬血蛋白水解物、豆粕蛋白水解物的生長(zhǎng)和飼料利用效果不如魚(yú)蛋白水解物與酵母蛋白水解物，推測(cè)影響對(duì)蝦生長(zhǎng)和飼料利用效果的主要原因是氨基酸平衡被破壞，“水桶效應(yīng)”產(chǎn)生，導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢，蛋白效率比降低，蛋白源缺乏某種或某些必需氨基酸，會(huì)產(chǎn)生對(duì)生長(zhǎng)的抑制作用[14-16]。凡納濱幼蝦對(duì)飼料中氨基酸的的需求量分別為1.51%蘇氨酸、2.05%賴(lài)氨酸、0.89%蛋氨酸、2.16%精氨酸[17-19]；實(shí)驗(yàn)飼料氨基酸含量經(jīng)檢測(cè)，F(xiàn)PH中含1.45%蘇氨酸，PBPH中含0.64%蛋氨酸、1.99%精氨酸，SPH中含1.39%蘇氨酸、0.66%蛋氨酸、1.73%賴(lài)氨酸，YPH中含0.70%蛋氨酸、1.83%賴(lài)氨酸，其氨基酸含量均低于對(duì)蝦實(shí)際需求量。

3.2 不同來(lái)源蛋白水解物對(duì)凡納濱對(duì)蝦血清和肝胰臟非特異性免疫的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在血清和肝胰臟中，添加魚(yú)蛋白水解物和酵母蛋白水解物組的堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力要優(yōu)于添加豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物組。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加5%魚(yú)蛋白水解物替代魚(yú)粉時(shí)，中國(guó)對(duì)蝦(Penaeus chinensis)肝胰臟中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和溶菌酶活性顯著高于其他組(P＜0.05)[20]，飼料中添加2%酵母蛋白水解物替代魚(yú)粉時(shí)，試驗(yàn)組大菱鲆幼魚(yú)血清溶菌酶、肝臟酸性磷酸酶、一氧化氮合酶及肝臟超氧化物歧化酶活性均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)[13]，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基本一致的。本實(shí)驗(yàn)中魚(yú)蛋白水解物和酵母蛋白水解物在免疫相關(guān)酶活性和抗氧化能力方面效果要優(yōu)于豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物，推測(cè)可能與水解過(guò)程中產(chǎn)生的活性小肽有關(guān)，其具有抗氧化性、增強(qiáng)免疫力等生理功能[7]；水解過(guò)程中產(chǎn)生的生物活性肽具有免疫增強(qiáng)和抗菌性，其對(duì)提高大西洋鱈魚(yú)(Gadus morhua)魚(yú)苗的非特異性免疫有一定作用[21,6]；YPH在一定程度上能提高對(duì)蝦的免疫能力，除了生物活性肽影響之外，核苷酸和B族維生素也具有提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力的作用[22-24]。許丹丹等研究表明，飼料中添加核苷酸混合物可顯著提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺堿性磷酸酶活性[23]。周小秋指出，B族維生素可以通過(guò)提高血清溶菌酶和酸性磷酸酶活性增強(qiáng)殺菌能力[24]。本實(shí)驗(yàn)中，添加豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、溶菌酶、一氧化氮合酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性和總抗氧化能力低于添加魚(yú)蛋白水解物和酵母蛋白水解物組，推測(cè)因其生長(zhǎng)不理想從而抑制了非特異性免疫的表達(dá)效果。研究表明，豬血水解獲得豬血多肽或游離氨基酸，豬血多肽具有抗氧化性、增強(qiáng)免疫功能活性等功能[25]。周學(xué)文發(fā)現(xiàn)酶解豬血粉可以增強(qiáng)肉雞抗病能力[26]，豆粕經(jīng)酶解獲得多肽及游離氨基酸等蛋白消化產(chǎn)物，同時(shí)大豆多肽可以增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物免疫力，具體表現(xiàn)在提高其存活率及調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫系統(tǒng)的功能[27-28]。

4 小結(jié)

在本實(shí)驗(yàn)條件下，適量的四種不同來(lái)源蛋白水解物替代魚(yú)粉后投喂凡納濱對(duì)蝦幼體，綜合生長(zhǎng)、飼料利用及血清和肝胰臟免疫相關(guān)酶活性的結(jié)果表明，魚(yú)蛋白水解物替代魚(yú)粉的效果最好，其次是酵母蛋白水解物、豬血蛋白水解物和豆粕蛋白水解物。