■趙 玲 孫然然 朱洛毅 孫鋁輝 齊德生

（華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，湖北武漢430070）

黃曲霉毒素被認為是一種致癌性最強且存在最普遍的一種毒素。如何降低黃曲霉毒素的危害一直是很多科研工作者努力的目標。目前國內(nèi)外去除黃曲霉毒素的方法主要有物理法、化學法以及生物法[1]。其中生物法中的生物降解脫毒法被認為是比較高效安全的一種降解方法[2]。本實驗室前期已有報道，從土壤中篩選出的一種黃曲霉毒素降解菌株經(jīng)鑒定為芬氏纖維微菌（Cellulosimicrobium funkei），屬于纖維微菌屬。將該菌與AFB1一同灌服給雛鴨時，相比于單獨灌服AFB1，改善了肉鴨的生長性能，也改善了肉鴨肝臟的損傷程度。結果表明，該芬氏纖維微菌可以改善受AFB1感染的肉鴨的生長性能以及減緩肝臟的損傷[3]。但是芬氏纖維微菌對于肉鴨盲腸微生物菌群而言屬于外來菌種，它是否會對盲腸微生物菌群造成影響尚未有研究報道。本試驗就以雛鴨為試驗對象，分為5個處理組，每組均飼喂普通日糧，通過經(jīng)口灌服AFB1、芬氏纖維微菌菌液以及芬氏纖維微菌菌液和AFB1混合物，針對盲腸微生物菌群的變化做相關檢測及探究。該試驗的探究結果可以為相關產(chǎn)品的開發(fā)提供科研依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

伊紅-美藍（EMB）瓊脂、MRS培養(yǎng)基、Wilkins-Chalgren瓊脂、TPY瓊脂（以上均購于青島高科園海博生物技術有限公司）；芬氏纖維微菌（華中農(nóng)業(yè)大學）；黃曲霉毒素B1(標準品，純度≥99%，美國Sigma公司)。

1.2 試驗動物及日糧

120只1 日齡櫻桃肉谷鴨（購于武漢市春江禽業(yè)有限責任公司），基礎日糧預飼3 d后，選取100只健康、體重相近的雛鴨，隨機分為5個組，每組4個重復，每個重復5只雛鴨。日糧均采用商品日糧，且未檢出黃曲霉毒素

具體分組如下：

對照組：灌服1 ml無菌LB培養(yǎng)基，連續(xù)灌胃14 d

試驗組1：C.funkei菌低劑量組，灌服1 ml C.funkei菌液(1×108cfu/ml)，連續(xù)灌胃7 d，第8 d開始停止灌服菌液，只灌服1 ml無菌LB培養(yǎng)基，每天灌胃1次。

試驗組2：C.funkei菌高劑量組，灌服1 ml C.funkei菌液（1×1010cfu/ml），連續(xù)灌胃7 d，第8 d開始停止灌服菌液，只灌服1 ml無菌LB培養(yǎng)基。

試驗組3：AFB1處理組，按照0.1 mg/(kg·BW)的量灌服AFB1溶液+1 ml無菌LB培養(yǎng)基，連續(xù)灌胃14 d，每天灌胃1次。

試驗組4：AFB1+C.funkei菌處理組，按照0.1 mg/(kg·BW)的量灌服AFB1溶液+1 ml無菌LB培養(yǎng)基，連續(xù)灌胃14 d。

各組均飼喂肉鴨商品日糧，且日糧中未檢出黃曲霉毒素

1.3 飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)試驗在武漢市華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院動物營養(yǎng)代謝實驗室進行。試驗肉鴨采用分欄網(wǎng)上平養(yǎng)方式。試驗前一周，將鴨舍、鴨籠徹底清掃和沖洗，封好門窗后用高錳酸鉀和福爾馬林熏蒸消毒，3 d后將門窗打開通風換氣4 d。肉鴨預飼期3 d，試驗期14 d（即4～17日齡），整個試驗期，每天喂料2次，所有肉鴨自由采食和飲水。每天觀察肉鴨精神、攝食、飲水及死亡等情況。

1.4 樣品采集和處理

分別于試驗期第7 d和第14 d，屠宰鴨子，取出兩側盲腸，用脫脂棉扎口，用于盲腸微生物的測定。

1.5 盲腸微生物指標測定

總需氧菌計數(shù)用LB瓊脂培養(yǎng)基，總厭氧菌計數(shù)用Wilkins-Chalgren瓊脂，乳酸菌計數(shù)用MRS瓊脂，大腸桿菌計數(shù)用伊紅-美藍瓊脂，雙歧桿菌計數(shù)用TPY瓊脂。C.funkei用LB瓊脂培養(yǎng)基。采用平板涂布計數(shù)法進行盲腸微生物的計數(shù)。無菌條件下取0.5 g盲腸內(nèi)容物加入5 ml生理鹽水進行10倍梯度稀釋，然后依次稀釋至10-5或10-6稀釋度，從適宜的稀釋度中吸取100 μl均勻涂布于瓊脂平板，然后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，乳酸菌、雙歧桿菌和總厭氧菌在厭氧條件下培養(yǎng)48 h，大腸桿菌需氧培養(yǎng)24 h，C.funkei細菌和總需氧菌在有氧條件下培養(yǎng)48 h。

1.6 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2007初步處理后，利用SAS8.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，用Duncan's多重比較進行差異顯著性分析，當P＜0.05時認為有顯著性差異，所有試驗數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標準差”表示（M±SD）。

2 結果

2.1 降解菌株對肉鴨盲腸微生物菌群的影響(見表1、表2)

不同處理對腸道中大腸桿菌的數(shù)量均有影響。與對照組相比，試驗組1，2均可以顯著降低雛鴨盲腸中大腸桿菌的數(shù)量（P＜0.05）。而對腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量沒有影響（P＞0.05）。試驗組2會使總需氧菌和總厭氧菌的數(shù)量顯著升高（P＜0.05）。

表14 ～10 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

表211 ～17 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

在試驗第14 d檢測雛鴨盲腸內(nèi)主要微生物的數(shù)量變化，與對照組相比，試驗組1,2的各盲腸微期生物的數(shù)量與對照組均沒有差異（P＞0.05）。而且也未檢測出芬氏纖維微菌的殘留。

2.2 芬氏纖維微菌菌株對AFB1暴露下雛鴨盲腸微生物菌群的影響(見表3、表4)

表34 ～10 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

表411 ～17 d雛鴨盲腸內(nèi)容物微生物含量[log10（cfu/g內(nèi)容物）]

與對照組相比，試驗組3使腸道內(nèi)大腸桿菌的數(shù)量顯著升高（P＜0.05），使乳酸桿菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05）。而試驗組4各項微生物指標與對照組均無顯著差異（P＞0.05）。

與對照組相比，試驗組3、4均會使大腸桿菌的數(shù)量顯著升高（P＜0.05），但是試驗組3使大腸桿菌數(shù)量增加的幅度更大。試驗組3使腸道中總需氧菌顯著增加（P＜0.05），使乳酸桿菌的數(shù)量顯著降低（P＜0.05），對總厭氧菌和雙歧桿菌的數(shù)量沒有顯著影響（P＞0.05）。試驗組4與對照組相比，各項微生物指標均無顯著差異（P＞0.05）。

由以上結果可知，雛鴨灌服AFB1后，可引起盲腸大腸桿菌數(shù)量上升、乳酸菌數(shù)量降低，造成盲腸微生物區(qū)系紊亂。對于AFB1暴露雛鴨，添加芬氏纖維微菌可以降低大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量，在一定程度上可以改善盲腸微生物區(qū)系。

3 討論

3.1 芬氏纖維微菌對肉鴨盲腸微生物的影響

動物腸道菌群組成最大決定因素是飼糧，腸道微生物菌群組成受到飼料原料，飼糧脂肪、蛋白質、碳水化合物營養(yǎng)水平，飼糧物理結構（顆粒大小和加工技術），外源飼用酶類以及飼用抗生素（抗生素和抗球蟲藥）使用的影響[4]。當外源添加微生物在動物飼料中時，應保證外來微生物不會造成動物腸道微生物菌群的紊亂。飼用微生物主要特點之一是可以改善宿主腸道微生態(tài)平衡。動物體內(nèi)的大腸桿菌是機體必不可少的細菌，屬于動物腸道的正常菌群，但是大腸桿菌的某些致病菌株會導致動物腹瀉及其它多種炎癥，造成巨大經(jīng)濟損失[5]。動物體內(nèi)還有一類可以改善宿主腸道健康的菌群—益生菌。益生菌種類很多，主要包括乳酸菌、腸球菌、雙歧桿菌、片球桿菌、芽孢桿菌、埃希氏桿菌、乳球菌、大量的酵母菌及混合培養(yǎng)物等[6]。存在于動物腸道的益生菌主要有乳酸菌和雙歧桿菌。乳酸菌和雙歧桿菌是維持動物腸道健康的重要菌群，它們可以與其它厭氧菌共同作用占據(jù)腸粘膜表面，形成保護性的生物屏障，阻止有害菌的侵入定植[7]。

本試驗研究結果表明，對雛鴨連續(xù)灌服芬氏纖維微菌一周可以降低盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌的數(shù)量，對雛鴨灌服芬氏纖維微菌對乳酸菌和雙歧桿菌沒有影響。這可能是因為芬氏纖維微菌的胞外代謝產(chǎn)物有抑菌成分，可以抑制大腸桿菌的生長。另外，在動物腸道內(nèi)存在微生物奪氧機制，當好氧或兼性厭氧菌進入腸道后，在生長繁殖過程中可消耗腸道內(nèi)的氧氣，降低腸道內(nèi)氧氣濃度，抑制其它需氧菌的生長，促進厭氧菌的生長，從而維持腸道微生態(tài)區(qū)系的平衡[8]。芬氏纖維微菌屬于兼性厭氧菌，在生長繁殖過程中可能也存在上述奪氧機制，從而抑制了需氧菌大腸桿菌的生長。在本試驗中對雛鴨灌服1010cfu/d的芬氏纖維微菌盲腸總厭氧菌和總需氧菌均顯著上升，分析原因可能是因為該菌株屬于兼性厭氧菌，在有氧和厭氧條件下均可生長，在測定總需氧菌和總厭氧菌時均含有大量芬氏纖維微菌菌落，從而使這兩項指標顯著升高。

動物腸道內(nèi)膽鹽、胃內(nèi)低pH環(huán)境以及其它酶類對微生物都有潛在的滅活作用[9]。飼用微生物對其具有一定的耐受性才能在胃腸道生長繁殖從而發(fā)揮生理功能[10]。本試驗在雛鴨盲腸內(nèi)容物中檢測到芬氏纖維微菌說明該菌株經(jīng)過胃腸道酸堿環(huán)境后可以存活，可以耐受動物胃腸道環(huán)境，為以后在動物飼料中的應用提供了依據(jù)。同時，對雛鴨停止灌服該菌一周后，在盲腸內(nèi)沒有檢測到該菌，說明該菌株是胃腸道的過路菌，無法在腸道定植。

3.2 AFB1對肉鴨盲腸微生物的影響以及芬式纖維微菌對AFB1暴露肉鴨的盲腸微生物區(qū)系的改善作用

前期的研究結果表明，給雛鴨灌服AFB1，雛鴨的日增重明顯下降，料重比增大，生長性能受到影響，AFB1的毒性作用會嚴重影響到肉鴨的生產(chǎn)。雛鴨在第一周肝臟出現(xiàn)腫脹，大面積的變性、壞死，毒素攝入一周后，近1/2肝組織被增生的膽管樣細胞取代，兩周后，接近4/5肝組織被增生的膽管樣上皮細胞取代，說明AFB1對雛鴨肝損傷極為嚴重[3]。

動物的肝功能狀態(tài)與腸道微生態(tài)環(huán)境存在緊密的關系。肝臟可以清除來自腸道的酚類、氨類以及內(nèi)毒素等物質。當肝臟出現(xiàn)功能障礙時，腸道產(chǎn)生的有害物質不能被肝臟代謝分解，有害物質積存在腸道，使腸道環(huán)境發(fā)生改變，導致腸道菌群失調(diào)[11]。Li等[12]研究報道慢性肝病患者會出現(xiàn)腸道微生態(tài)失衡的癥狀，具體表現(xiàn)為以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌增多，而腸道專性厭氧菌顯著減少。

肝臟是AFB1作用的靶器官，在本試驗中發(fā)現(xiàn)，AFB1處理組雛鴨與空白對照組相比，大腸桿菌和總需氧菌數(shù)量顯著上升，而有益菌乳酸菌顯著降低，雙歧桿菌也有所降低。結合本實驗室之前的研究結果[3]，AFB1導致雛鴨肝臟受損的同時也使腸道微生態(tài)環(huán)境發(fā)生紊亂。對AFB1暴露雛鴨灌服芬氏纖維微菌可以顯著降低大腸桿菌和總需氧菌的數(shù)量，乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量也有所上升，說明該菌可使腸道菌群趨于正常。分析其原因，可能是由于該菌可以降解腸道內(nèi)的AFB1，減少了AFB1的吸收。從而可以減輕其對肝臟的損傷作用[3]。

4 結論

在肉鴨飼糧中添加一定濃度的芬氏纖維微菌可以有效緩解AFB1對肉鴨盲腸微生物的影響，在一定程度上改善肉鴨腸道微生物區(qū)系。這一實驗結論可以為相關的可緩解黃曲霉毒素對畜禽的損害的產(chǎn)品的開發(fā)利用提供科研依據(jù)。