■劉秀麗 金 龍 李 鋒 裴 樂

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；2.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部列橋研究中心，加拿大列橋T1J 4B1；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

植物單寧(Tannins)是一類普遍存在的多酚類化合物，根據(jù)來源不同具有不同的抗生活性。如紫色達利菊牧草縮合單寧含量很高[1]，長期飼喂可以減少反芻動物糞中大腸桿菌O157：H7的排出，降低環(huán)境污染。研究也顯示，從9種牧草中分離的縮合單寧，僅僅是紫色達利菊單寧表現(xiàn)出了較強抗E.coliO157：H7活性的作用[2-3]。

據(jù)報道，兒茶酚素-綠茶中單寧單體的抗大腸桿菌活性是由于對細菌細胞膜脂質(zhì)層的破壞和外膜通透性的增加而起作用；從葉白千層（茶樹）中分離的精油、百里香酚等酚提取物都是通過改變細菌細胞外膜和脂質(zhì)層構(gòu)成而對革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抑制作用。在香精油中酚類化合物的抗微生物活性似乎是與羥基的存在和微生物酶的失活有關(guān)，但最可能是和細胞膜相關(guān)的這些基團引起了細胞成分如脂肪酸和磷脂的改變[4]，從而減弱細胞的能量代謝和影響遺傳物質(zhì)的合成。本試驗?zāi)康木褪橇私鈫螌幾饔糜诩毦毎?，細胞壁脂肪酸組成的變化，為闡明紫色達利菊所含縮合單寧抑制大腸桿菌的作用機理提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

1株非致病性大腸桿菌ATCC25922，來自加拿大農(nóng)業(yè)部萊斯布里奇研究中心（Lethbridge research cen-tre culture collection.Canada）的微生物培養(yǎng)室。

1.1.2 紫色達利菊和紅豆草單寧

紫色達利菊單寧和紅豆草單寧系加拿大農(nóng)業(yè)部萊斯布里奇研究中心反芻動物營養(yǎng)實驗室提取，純度均大于98.0%。

1.1.3 所需主要儀器設(shè)備

氣相色譜儀（Hewlett Packard GC System 6890,Mississauga,ON,Canada）；OxiSelect? Hydrogen Peroxide Assay Kit(Colorimetric，STA-343，Cell biolabs，Inc)；凍干機（Goldfisch Apparatus，Laboratory construction Co.,Kansas City,Mo.USA)；紫外分光光度計（Metertech INC，SP-8001）；氮氣吹掃儀（OA-SYS heating evaporator 24 needles,N-EVAPTM112.USA）；高速離心機(Sorvall RC 5B PLUS，SLA-1500)。

1.2 方法

1.2.1 氣相色譜儀儀器條件

離子火焰檢測器,SP-2560石英毛細管柱（75 m×0.18 mm×0.14 μm，Supelco Inc.,Oakville,ON,Canada）。通過20∶1（20∶1 split）進樣1 μl的己烷提取液。開始溫度55℃維持5 min，之后按15℃/min增加到155℃，并維持56 min；再以10℃/min增加到240℃，最后再維持15 min。氫氣作為載體：排出壓力16.3 psi，流速為0.3 ml/min；氦氣作為尾吹氣，流速：10 ml/min。

1.2.2 樣品準(zhǔn)備

將加單寧（PPC，SF）和未加單寧培養(yǎng)的細菌，分別在37℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)，每個濃度（紫色達利菊單寧濃度分別為0、10、50 μg/ml；紅豆草單寧濃度分別為0、50、200 μg/ml）做了3個重復(fù)，濃度的選擇是根據(jù)單寧的最小抑菌量（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），PPC 為20～40 μg/ml，SF 為 100～150 μg/ml。培養(yǎng)10 h后取出，離心（12 000 r/min，4 ℃）10 min，棄去上清液，用PBS重懸細菌，再同樣離心，重復(fù)3次洗滌。最后，傾去上清液，凍干成粉末備用。

1.2.3 樣品測定

參照Evans[5]的脂肪酸提取方法，準(zhǔn)確稱取大腸桿菌凍干粉約50 mg到25 ml試管（事先用甲醇洗3遍）中，每個樣品稱取一個。加入CH3Cl3∶HCH3OH=2∶1 4 ml，振搖，靜止過夜。混勻，離心（12 000 r/min、4℃）10 min，移出上清液到另一干凈試管。沉淀再加4 ml液體(CH3Cl3∶HCH3OH∶H2O=2∶1∶0.8)，靜止2 h，離心（12 000 r/min、4 ℃）10 min。移出并合并兩次上清液，總體積為V。加入V/3.8 ml的氯仿和等體積的水。待分層后，取出下層即為脂層，40℃氮氣吹干。氮氣吹干的樣品加入100 μl Nonadecanoic acid(C19∶0)methyl ester作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。加入2 ml甲醇鈉（用甲醇溶解成濃度為0.5 mmol/l），搖勻，充N2，把樣品放到50℃水浴中10 min。等溫度降下來后加入 1 ml BF3(14%Boron triflouride)，充 N2，把樣品放到50℃水浴中10 min；溫度降下來之后加入5 ml水和5 ml己烷，混勻。靜止10 min，待分層，上層即為測試樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，上氣相色譜儀分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

脂肪酸數(shù)據(jù)是通過Agilent工作站B.01.03離線處理系統(tǒng)獲得數(shù)據(jù)，經(jīng)脂肪酸分析軟件進行計算，脂肪酸結(jié)果分析是通過SAS 9.0中ANOVA進行。

2 試驗結(jié)果與分析

在培養(yǎng)大腸桿菌時加入不同濃度的單寧，經(jīng)10 h作用后，通過氣相色譜觀察從細菌細胞膜提取的脂肪酸的變化。從表1可以看到，ATCC25922細胞壁脂肪酸由63.49%（＞50%）的飽和脂肪酸（Saturated Fatty Acid，SFA)和36.51%的不飽和脂肪酸（Unsaturated Fatty Acid，USFA）構(gòu)成，其中棕櫚酸(C16∶0)、棕櫚油酸(C16∶1)、C16∶0-2OH 和 C18∶1 c11 是構(gòu)成 E.coil脂質(zhì)部分的主要脂肪酸。在加入紫色達利菊單寧后，與對照相比，飽和脂肪酸明顯升高，特別是棕櫚酸(C16∶0)顯著增加，棕櫚油酸(C16∶1)和異油酸(C18∶1)顯著降低；而隨著單寧濃度的增加，僅僅表現(xiàn)了肉豆蔻酸(C14∶0)的顯著降低和異油酸(C18∶1)的顯著升高；與低濃度相比，肉豆蔻酸(C14∶0)的顯著降低，棕櫚酸(C16∶0)顯著降低，棕櫚油酸(C16∶1)和異油酸(C18∶1)顯著升高；而加入紅豆草單寧后，與對照相比，肉豆蔻酸(C14∶0)和棕櫚酸(C16∶0)顯著降低，異油酸(C18∶1)顯著升高；而隨著單寧濃度的增加，表現(xiàn)了肉豆蔻酸(C14∶0)和棕櫚油酸(C16∶1)的顯著降低，C16∶0-2OH和C18∶1 c11的顯著升高；與低濃度相比，棕櫚油酸(C16∶1)和C18∶1 c11的顯著降低。

成對脂肪酸比例的變化將影響細胞膜的流動性。在加入單寧培養(yǎng)細菌前后，觀察單寧對成對脂肪酸的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度（低于MIC）PPC單寧，使成對脂肪酸比例（飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸）增加，而高濃度時沒有明顯變化，原因可能是縮合單寧對細菌細胞的聚集作用和H2O2對細胞毒害作用的雙重結(jié)果。在低濃度時，紫色達利菊單寧對細胞的聚集、對蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體的聚集作用程度小，而H2O2發(fā)揮了毒害作用，將不飽和脂肪酸氧化成飽和脂肪酸，成對脂肪酸比例增加。而對于低濃度（低于MIC）的紅豆草單寧，H2O2的產(chǎn)生量小，所以未起到氧化作用；而在高濃度時，主要脂肪酸C16∶0有明顯的增加，紅豆草單寧的聚集作用要比紫色達利菊單寧弱，因此高濃度時仍然是H2O2對細胞毒害作用占主要地位。從圖1、圖2、圖3、圖4中看到，在加入10 μg/ml紫色達利菊單寧時，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA均顯著升高（P＜0.01）；而加入50 μg/ml紫色達利菊單寧時，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA與對照相比差異不顯著，與低濃度顯著降低（P＜0.05）。

表1 經(jīng)單寧處理的大腸桿菌細胞主要脂肪酸比例的變化

圖1 紫色達利菊單寧和紅豆草單寧對大腸桿菌細胞脂肪酸C16∶0/C16∶1比例的變化

圖2 紫色達利菊單寧和紅豆草單寧對大腸桿菌細胞脂肪酸TT16∶0/TT16∶1比例的變化

而在加入50 μg/ml紅豆草單寧時，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、C18∶0/C18∶1、SFA/USFA的變化與對照差異不顯著；而加入200 μg/ml紅豆草單寧時，C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1變化與對照相比顯著升高（P＜0.05），C18∶0/C18∶1、SFA/USFA差異不顯著；C16∶0/C16∶1、TT16∶0/TT16∶1、SFA/USFA比低濃度顯著升高（P＜0.05），C18∶0/C18∶1差異不顯著。

圖3 紫色達利菊單寧和紅豆草單寧對大腸桿菌細胞脂肪酸C18∶0/C18∶1比例的變化

圖4 紫色達利菊單寧和紅豆草單寧對大腸桿菌細胞脂肪酸SFA/USFA比例的變化

3 討論

對于新型抗生物質(zhì)來說，脂質(zhì)合成途徑似乎是一個重要的過程[6-8]。由于單寧對細胞質(zhì)膜似乎成了作用的主要位置，并影響脂肪酸的構(gòu)成和結(jié)構(gòu)的改變。在對百里香酚、檸檬烯、香芹酚等多酚化合物進行研究時，低于MIC的量會使不飽和脂肪酸含量增加[9]，從而增加膜的流動性[10]；另一研究表明，用這些化合物處理細胞2 h后，不飽和脂肪酸減少，而飽和脂肪酸增加[11]。而本試驗的結(jié)果是，在加入低于MIC的紫色達利菊單寧時，飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例增加，而對于紅豆草單寧沒有影響；在高于MIC時，紅豆草單寧僅表現(xiàn)主要成對脂肪酸的比例增加?？傊?，說明了多酚類化合物作用于細菌細胞膜的機制可能是干擾膜脂質(zhì)層，并引起細胞膜結(jié)構(gòu)的變化。

細胞通過多組分膜脫氫酶來產(chǎn)生飽和脂肪酸[12-13]。許多研究也表明，酚類和萜烯類化合物都作用于細胞外膜，增加其通透性[14-16]，可能由于膜物質(zhì)的流失，脫氫酶分散出來對膜上脂肪酸產(chǎn)生影響。在膜脂質(zhì)層中飽和脂肪酸含量高會導(dǎo)致膜流動性降低，硬度增加[10]，而不飽和脂肪酸太少，隨著細胞的生長和磷脂的合成，不久細胞就會代謝失衡、調(diào)亡[17]。如苯、苯胺等可溶于水的親脂物質(zhì)在低濃度時都能引起飽和脂肪酸和總磷脂濃度的增加，原因可能是需要一個較高密度的膜，通過飽和脂肪酸體現(xiàn)出來。

4 結(jié)論

單寧能夠引起細菌細胞壁脂肪酸結(jié)構(gòu)的變化，我們認為這可能是其抑制細菌生長的一個原因，也為闡明單寧的抑菌機理提供一個理論支持。隨著多酚化學(xué)及結(jié)構(gòu)的不斷研究發(fā)展,對多酚的利用是必然趨勢。植物多酚作為一類可再生的綠色資源，必將成為人類充分利用的重要資源之一。