■梁玉樹(shù) 易錫斌 何開(kāi)蓉 何蕓蕓 張麗萍 李良春

（1.西南科技大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，四川綿陽(yáng) 621000；2.新希望六和股份有限公司，山東青島 266555；3.四川新希望畜牧科技有限公司，四川成都 610017；4.四川理工學(xué)院材料與化學(xué)工程系，四川自貢 643000）

維生素是生物體維持生命活動(dòng)所必需的一類有機(jī)化合物，在生物體生長(zhǎng)、代謝和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。水溶性維生素主要包括硫胺素（VB1）、核黃素（VB2）、煙酸（VB3）、吡哆醇（VB6）、生物素（VB7）、鈷胺素（VB12）等。隨著人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的畜禽消費(fèi)需求、畜牧業(yè)的迅速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖逐漸規(guī)模化、集約化、專業(yè)化，畜禽的營(yíng)養(yǎng)和健康越來(lái)越受到重視。維生素作為維持動(dòng)物機(jī)體健康的重要營(yíng)養(yǎng)元素，在畜禽飼料中是不可或缺的。飼料中的各種維生素的量必須達(dá)到動(dòng)物體的需要量，才能保證動(dòng)物維持體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)平衡，達(dá)到健康生長(zhǎng)，因此加強(qiáng)飼料中維生素含量檢測(cè)是確保飼料產(chǎn)品品質(zhì)的基本途徑，開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確、便捷的測(cè)定方法將成為一項(xiàng)重要的研究課題。維生素檢測(cè)方法有光度法、微生物法、酶標(biāo)法等。隨著科技的發(fā)展，儀器分析法相繼建立，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)建立了各種水溶性維生素檢測(cè)方法-高效液相色譜法，樣品前處理繁瑣耗時(shí)，針對(duì)飼料中的含量低于20 mg/kg水溶性維生素?zé)o法檢測(cè)，并且干擾較大，無(wú)法準(zhǔn)確定性和定量。

近年采用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定水溶性維生素的文獻(xiàn)較多，E.E.Abano等評(píng)述了1980～2014年采用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定水溶性維生素的部分文獻(xiàn)，Kamman等采用高效液相色譜同時(shí)測(cè)定維生素B1和維生素B2。Gatti等采用液相色譜熒光檢測(cè)器檢測(cè)了牛奶和藥片中的VB6、VB2。Heudi等采用反相高效液相色譜分離預(yù)混飼料中的水溶性維生素并用紫外檢測(cè)器檢測(cè)其含量。Lebiedzinska等采用反相液相色譜電化學(xué)庫(kù)倫檢測(cè)器及紫外檢測(cè)器檢測(cè)了動(dòng)植物食品中的 VB1、VB6、VB12。Vidovic等采用高效液相色譜測(cè)定了多種維生素糖漿中的水溶性維生素及防腐劑含量。Ciulu等采用反相高效液相色譜法測(cè)定了蜂蜜、干果蔬菜中的水溶性維生素。Andreas E.Karatapanis等研究了水溶性維生素在單柱高效液相色譜中的分離狀況，Israel Olusegun Otemuyiwa等采用高效液相色譜法測(cè)定同時(shí)測(cè)定食品中水溶性維生素。Baifen Huang等報(bào)道了采用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定了強(qiáng)化嬰兒食品中4種水溶性維生素。莫彩娜等報(bào)道了采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定配合飼料中維生素B1和維生素B2的方法。梁波報(bào)道了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定功能飲料中VB1、VB3、VB6、VB12以及VC含量的方法。然而，針對(duì)低含量、成分復(fù)雜、干擾較多的配合飼料樣品中6種水溶性維生素含量的同時(shí)檢測(cè)未見(jiàn)研究報(bào)道。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時(shí)檢測(cè)6種水溶性維生素的檢測(cè)方法，應(yīng)用于配合飼料及預(yù)混料中6種水溶性維生素的定性定量檢測(cè)，將提高維生素的檢測(cè)效率和準(zhǔn)確性，在高效、低成本檢測(cè)飼料中維生素含量方面具有重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260-6460液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀配電噴霧離子源[ESI（美國(guó)安捷倫公司）]，AB-135型電子分析天平（梅特勒托利多上海有限公司）；LD5-2B離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；旋渦混勻器MS3（德國(guó)IKA）。

乙睛、甲醇(色譜純，默克公司)；甲酸、乙酸銨、氨水(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉、氯化鈉(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))；硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素(含量99.5%，sigma公司)。

魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料樣品由四川新希望畜牧科技有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取適量的硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇、生物素、鈷胺素標(biāo)準(zhǔn)品，用0.02 mol乙酸銨(pH=4.0)配制質(zhì)量濃度為1 000.0 mg/l標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作中間液：準(zhǔn)確分別移取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量 VB1、VB3濃度為 1 mg/l，VB2、VB7、VB12濃度為 10 mg/l，VB6為 0.5 mg/l的混合標(biāo)準(zhǔn)工作中間液。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液：吸取一定體積的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作中間液，配成濃度以VB6計(jì)，濃度分別為1、2、5、10、20 μg/l標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。

0.02 mol/l乙酸銨溶液（pH=4.0）：稱取1.54 g乙酸銨于1 L容量瓶中，加適量超純水超聲溶解，定容至刻度。用乙酸調(diào)節(jié)pH值為4.0，用0.45 μm水相濾膜，過(guò)濾備用。

1.2 樣品處理

稱取飼料樣品0.5～2 g于100 ml容量瓶中，加入20 ml 0.02 mol/l乙酸銨溶液，超聲提取20 min，冷卻定容，離心，用0.22 μm水相濾膜，過(guò)濾上機(jī)。

1.3 色譜與質(zhì)譜條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Capcell PAK ADME(2.1 mmI.D×150 mm，3 μm)；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸甲醇溶液；流動(dòng)相B：0.02 mol/l乙酸銨溶液，采用梯度洗脫程序，流速為0.3 ml/min；梯度條件為：100%B；0～12 min，100%～10%B；12～14 min，10%B；14.01 min，100%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

試驗(yàn)采用甲醇溶解6種水溶性維生素分別對(duì)其進(jìn)行母離子、子離子全掃描，得到離子流圖譜如圖1。

圖1 6種水溶性維生素全掃描的離子流

ESI正離子掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）參數(shù)：干燥氣溫度325℃，干燥氣流速9 L/min，霧化氣壓力45 psi，鞘氣溫度300℃，流速11 L/min，毛細(xì)管電壓3 500 V，噴嘴電壓500 V,其他質(zhì)譜優(yōu)化條件如表1所示。

表1 MRM監(jiān)測(cè)模式下6種水溶性維生素的儀器優(yōu)化條件

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

比較水、0.02 mol/l甲酸銨（pH=4.0）、0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0）、20%甲醇水溶液幾種提取劑分別對(duì)樣品提取的效果。上機(jī)檢測(cè)均能得到很好的分離，但日間重現(xiàn)性有顯著差異，其中用0.02 mol/l甲酸銨（pH=4.0）、0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0）重現(xiàn)性好，如圖2。然而，用0.02 mol/l乙酸銨水溶液的作為流動(dòng)相時(shí)，其各組分響應(yīng)值達(dá)到最優(yōu)，故選擇用0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0）作為樣品提取液。

2.2 樣品提取時(shí)間的選擇

稱取樣品，加入0.02 mol/l乙酸銨（pH=4.0），超聲提取0～30 min，以每5 min為時(shí)間間隔點(diǎn)，比較得出超聲時(shí)間以20 min為宜。

圖2 幾種提取溶劑穩(wěn)定性比較

2.3 色譜柱與流動(dòng)相的選擇

由于水溶性維生素有較強(qiáng)的極性，分別用C18-MGⅡ(pH 2～10)3 μm 2.0 mmI.D.×150 mm 柱、C18-MGⅢ(pH 2～10)3 μm 2.0 mmI.D.×150 mm柱、ADME(pH 2～10）3 μm 2.1 mmI.D.×150 mm柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×50 mm柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm 3.0×50 mm柱和Waters ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm 2.1×50 mm柱，比較其分離效果，得出ADME(pH 2～10）3 μm 2.1 mmI.D.×150 mm柱對(duì)水溶性維生素有很好的保留。

2.4 線性范圍、定量限、加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.4.1 線性范圍

配制與待測(cè)樣品相同基質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，使其濃度為分別1、2、5、10、20 μg/l，以選定的定量離子峰面積對(duì)質(zhì)量濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種水溶性維生素在仔豬料、育肥豬料、肉仔雞料、蛋雞料、肉鴨料基質(zhì)中的線性方程及相關(guān)系數(shù)如圖3所示。結(jié)果顯示，在不同基質(zhì)中，6種水溶性維生素在1～20 μg/l范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)（r2）為0.996～0.999，表明線性相關(guān)性良好。

圖3 6種水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

2.4.2 檢出限和定量限

采用空白樣品中添加目標(biāo)化合物的方法按1.2節(jié)樣品提取與凈化進(jìn)行處理后上機(jī)分析，以VB6計(jì)，濃度為1 μg/l得出的SNR如圖4所示。以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比確定定量下限，通過(guò)計(jì)算得出6種水溶性維生素的檢出限和定量限如表2所示。

圖4 信號(hào)噪音

2.4.3 加標(biāo)回收率

在溶劑空白中分別加入不同濃度的目標(biāo)維生素標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.2節(jié)中樣品前處理方法進(jìn)行處理，上機(jī)檢測(cè)其濃度，計(jì)算加標(biāo)回收率，加標(biāo)量、回收率及相對(duì)偏差如表2所示（n=6）。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

表2 加標(biāo)回收率、相對(duì)偏差、檢出限及定量限

應(yīng)用上述方法對(duì)魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料樣品進(jìn)行檢測(cè)，幾種飼料樣品中均能檢測(cè)出 VB1、VB2、VB3、VB6、VB7、VB12，其中 VB1的含量為3 731～8 939 μg/kg，VB2含量為8 860～14 880 μg/kg，VB3的含量為 6 744～14 720 μg/kg，VB6的含量為2 293～7 136 μg/kg，VB7含量為 356～457 μg/kg，VB12含量為339～485 μg/kg。證明該方法切實(shí)可行。本方法能夠滿足配合飼料同時(shí)檢測(cè)6中水溶性維生素的需求。

3 結(jié)論

本文建立了應(yīng)用UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料中6種水溶性維生素的分析方法。研究表明，6種水溶性維生素加標(biāo)回收率為83.5%～106.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)為3.5%～9.1%，各水溶性維生素的檢出限為0.05～1.97 μg/kg，定量下限為0.16～6.50 μg/kg。方法快捷、操作簡(jiǎn)單、節(jié)能環(huán)保、結(jié)果準(zhǔn)確，符合相關(guān)法律法規(guī)的要求，滿足日常檢測(cè)需要。