黃花草木犀總皂苷體外抗腫瘤作用研究

嚴銘銘，吳程彥，尉忠賢，付美麗，劉暢，田雙，邵帥*

(長春中醫(yī)藥大學，長春 130117)

摘要：目的以MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620幾種腫瘤細胞株為研究對象，體外加入黃花草木犀總皂苷，研究黃花草木犀總皂苷對幾種腫瘤細胞株的增殖抑制作用。方法CCK-8法檢測黃花草木犀總皂苷對5種腫瘤細胞株的增殖抑制作用。結果黃花草木犀總皂苷對MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620腫瘤細胞株均有細胞毒作用，但對正常細胞株的毒性作用則明顯較低，對MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620作用72 h時的IC50分別為0.45、0.73、1.05、1.17、1.19 mg/mL。結論黃花草木犀總皂苷能有效抑制5種腫瘤細胞株增殖，且對正常細胞株毒性較小，篩選出對黃花草木犀總皂苷最敏感的腫瘤細胞株為MCF-7、PC3M腫瘤細胞，值得進一步開展基礎及臨床研究。

關鍵詞：CCK-8;黃花草木犀總皂苷;細胞增殖

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.029

中圖分類號：R285.5文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)02-0191-02

基金項目:吉林省自然科學

作者簡介:嚴銘銘(1968-),女,教授,主要從事中藥創(chuàng)新藥物研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-12-20)

*通信作者:邵帥,電話-(0431)86172337,電子信箱-yanmm595@126.com

Anti-cancer effect of external saponins frommelilotusofficinalisL.

YAN Mingming,WU Chengyan,WEI Zhongxian,FU Meili,LIU Chang,TIAN Shuang,SHAO Shuai*

(Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of the saponins from melilotus officinalis L.on MCF-7,PC3M,ACC,A549 and SW620 cell lines proliferation in external.MethodsThe inhibitory effects of 5 cell proliferation were evaluated by CCK-8.ResultsThe results showed that the saponins from melilotus officinalis L.inhibited the growth in MCF-7,PC3M,ACC,A549 and SW620 cells.After 72 hours,The IC50 was 0.45,0.73,1.05,1.17 and 1.19 mg/mL,and displayed the no toxicity to normal cell.ConclusionThe saponins from melilotus officinalis L.can inhibit cell proliferation of five cell lines and it has low toxicity effect to normal cell line.we screened out the most sensitive cell lines which were MCF-7 and PC3M cancer cell lines.It is worth for further basic and clinical research.

Keywords:CCK-8;saponins of melilotus officinalis L.;cell proliferation

黃花草木犀(Melilotusofficinalis(L.))為長白山民間藥材，具有散瘀消腫、抗菌消炎、清熱解毒、解痙止痛等確切療效，黃花草木犀在國外應用較多，并為《歐洲藥典》(第5版)收錄,在英國作為抗水腫及調節(jié)腎靜脈循環(huán)的藥物，在荷蘭、德國、波蘭及奧地利作為抗聚集、抗氧化劑和保肝的正式植物藥[1-3]。為深入發(fā)掘開發(fā)黃花草木犀這一長白山民間藥用資源，我們對黃花草木犀進行了化學及藥理學研究，從中分離出含量為50%以上黃花草木犀總皂[4]。本研究應用Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8[5]法測定黃花草木犀總皂苷對6種腫瘤細胞株的增殖作用即藥物半數(shù)抑制濃度(50% concentration of inhibition IC50)，從中篩選出高效低毒的腫瘤細胞株，為黃花草木犀總皂苷對腫瘤的進一步實驗研究奠定基礎。

1材料

1.1細胞株MCF-7細胞株(人乳腺癌細胞)，PC3M細胞株(人前列腺癌細胞)，ACC細胞株(人腮腺癌細胞)，A549細胞株(人肺癌細胞)，SW620細胞株(人腸癌細胞),293T細胞株(人正常腎上皮細胞)均來自吉林大學基礎醫(yī)學部病理實驗室，于液氮中保存復蘇后使用。

1.2藥物黃花草木犀總皂苷由長春中醫(yī)藥大學研發(fā)中心研制，純度為90%以上，批號20130507。

2方法

2.1細胞的培養(yǎng)、傳代、凍存、復蘇細胞培養(yǎng)于含10%FCS的H-DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。即時換液，待細胞接近匯流80%時，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化,以1∶3的比例傳代培養(yǎng)。細胞凍存采用緩慢冷凍。凍存液中各成分比例為FCS∶H-DMEM∶DMSO=2∶7∶1，細胞濃度為5×105～1×106/mL,細胞經(jīng)過4 ℃30 min，-20 ℃1 h,-80 ℃過夜，置于液氮中長期保存。復蘇采用速融法。將細胞在37 ℃水浴中迅速融化，離心1 000 r/min，5 min，接種細胞于含10%FCS的H-DMEM培養(yǎng)基中。

2.2采用CCK-8法檢測藥物對細胞增殖的影響取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化，終止消化后，離心1 000 r/min，5 min，細胞計數(shù)，調整細胞濃度為2×104/mL，接種于96孔板，100 μL/孔。待細胞貼壁后，輕輕吸掉培養(yǎng)基開始加藥。實驗設空白對照組、陰性對照組及不同濃度藥物組，每一濃度設3個復孔，于37 ℃、5%CO2孵育72 h后，輕輕吸掉培養(yǎng)基,每實驗孔加10 μLCCK-8試劑和100 μL含10%FCS的H-DMEM培養(yǎng)基。37 ℃、5%CO2孵育2.5 h后，在Bio-red 550酶標儀上，在490 nm波長，測定各孔的吸光度值(A值)。按公式計算黃花草木犀總皂苷對各腫瘤細胞的生長抑制率(inhibitory rate,IR)=1—[(加藥組A值—空白對照A值)/(陰性對照A值)—空白對照A值)]×100%，計算出藥物對細胞的生長抑制率，得出IC50值。

2.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件。

3結果

黃花草木犀總皂苷對MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620幾種腫瘤細胞的生長具有抑制作用，其IC50分別為0.45、0.73、1.05、1.17、1.19 mg/mL，但對正常細胞株293T沒有毒性作用。結果見表1。

表1　黃花草木犀總皂苷對不同腫瘤細胞株細胞增殖的影響

4結論

黃花草木犀總皂苷對MCF-7、PC3M、ACC、A549、SW620幾種腫瘤細胞的生長均具有抑制作用，其中對MCF-7、PC3M腫瘤細胞株抑制作用較強，并對正常細胞株無細胞毒作用，表現(xiàn)出較好選擇性，這預示黃花草木犀總皂苷在治療人乳腺癌及人前列腺癌方面具有較好的應用前景。

本實驗通過CCK-8試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)檢測細胞增殖，原理為：該試劑中含有WST-8，它在電子載體1-Methoxy PMS作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲硂染料(Formazan)。生成的甲硂物的數(shù)量與活細胞的數(shù)量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。在應用過程中無需有機溶劑和放射性同位素參與，與傳統(tǒng)的MTT法[6]相比較具有操作簡便、無損失、結果準確、重現(xiàn)性好等特點。

參考文獻：

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