頭針結合艾灸對缺血缺氧性腦損傷幼鼠學習記憶能力及腦內BDNF的影響

周鈺1,牛相來1,林子歆1,方麗娜1,周偉1,霍新慧2*

(1.新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學，烏魯木齊 830054)

摘要：目的觀察頭針結合艾灸對腦癱幼鼠學習記憶能力的作用以及對腦源性神經生長因子(BDNF)的影響。方法7日齡清潔級新生SD幼鼠7窩共40只，隨機分為假手術組(A組)、模型組(B組)、頭針組(C組)、艾灸組(D組)和頭針結合艾灸組(E組),造模成功后，采用頭針、艾灸治療2周后，對幼鼠的運動功能進行評價，行為學觀察各組幼鼠Y迷宮實驗結果;術后18 d通過免疫組化法檢測大腦皮質BDNF陽性表達結果。結果假手術組Y迷宮實驗耗時和BDNF陽性表達結果均低于模型組；各治療組之間比較,Y迷宮實驗結果頭針結合艾灸組(67.71±7.60)優(yōu)于頭針組(74.73±8.06)(P=0.39<0.05)和艾灸組(81.18±10.1)(P=0.00<0.01);BDNF陽性表達結果頭針結合艾灸組(20.46±2.03)與頭針組(18.95±1.62)相比,P=0.43<0.05。結論治療組均能改善幼鼠的學習記憶能力和提高BDNF陽性表達結果，以頭針結合艾灸組效果最好；頭針結合艾灸治療可以提高BDNF水平的表達并發(fā)揮其生物活性，從而促進神經功能缺損的恢復，改善學習記憶能力。

關鍵詞：頭針；艾灸；缺血缺氧性腦損傷；BDNF；幼鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.02.026

中圖分類號：R245.32文獻標志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)02-0181-03

基金項目:新疆烏魯木齊市科技廳資助項目(Y121310018)。

作者簡介:周鈺(1972-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事針灸治療腦病的研究。

收稿日期:(責任編輯：趙玉芝2014-07-08)

*通信作者:霍新慧，電話-13565908032，電子信箱-349532885@qq.com

Effect of scalp acupuncture combined moxibustion on learning and memory ability with

hypoxic-ischemic brain damage rats and brain BDNF

ZHOU Yu1,NIU Xianglai1,LIN Zixin1,FANG Lina1,ZHOU Wei1,HUO Xinhui2*

(1.The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China;

2.Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China)

Abstract:ObjectiveObserved scalp acupuncture combined with moxibustion on learning and memory ability of rats with cerebral palsy as wellas for brain-derived neurotrophic factor (BDNF) impact.Methodshypoxic-ischemic brain damage in young rats were randomly divided into sham operation group (A),model group (group B),scalp acupuncture group (group C),moxibustion group (group D) and Scalp combined with moxibustion group (E),Using scalp acupuncture,moxibustion treatment after two weeks,motor function of rats to evaluate the behavior observed in young rats in each group Y maze test results;18d after by immunohistochemical assay cerebral cortex BDNF expression results.ResultsThe sham group Y maze consuming and BDNF expression results were lower than the untreated group;Comparison,Y maze test results scalp acupuncture combined with moxibustion group(67.71±7.60) than among the treatment groups scalp acupuncture group (74.73±8.06)(P=0.39<0.05) and moxibustion group (81.18±10.1)(P=0.00<0.01),BDNF expression results scalp acupuncture combined with moxibustion group (20.46±2.03)compared with scalp acupuncture group (18.95±1.62),P=0.43<0.05.ConclusionThe treatment group rats can improve learning and memory ability and increase the BDNF expression results to scalp acupuncture combined with moxibustion group best effect;Scalp therapy combined with moxibustion can increase the level of expression of BDNF and exert their biological activity,thus contributing to the recovery of neurological deficit,improve learning and memory abilities.

Keywords:scalp acupuncture;moxibustion;hypoxic-ischemic brain injury;BDNF;rat

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemicbrain damage,HIBD)是由于出生前或出生時缺氧所造成的，患兒多留有腦癱、癲癇等神經系統(tǒng)后遺癥[1]。目前，對于新生兒缺氧缺血性腦損傷的有效治療方法一直是國內新生兒科學的研究熱點。本實驗以腦源性神經生長因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)基因蛋白表達為指標，結合幼鼠學習記憶能力的觀察，探討頭針結合艾灸治療的腦保護作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物與分組7日齡清潔級新生SD幼鼠7窩共40只，雌雄不拘,體質量11.4～17.2 g，平均(13.9±2.5) g，動物由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號:FYXK(新2003-0001)，所有幼鼠自由攝食和飲水，生活在晝夜節(jié)律為12 h/12 h且保持一定濕度和25 ℃的空間內。隨機分為假手術組(A組)、模型組(B組)、頭針組(C組)、艾灸組(D組)和頭針結合艾灸組(E組)各8只。BDNF蛋白免疫組化檢測試劑盒和DBA顯色劑試劑(武漢博士德生物工程有限公司)，華佗牌不銹鋼一次性毫針，規(guī)格0.30 mm×25 mm(蘇州醫(yī)療用品有限公司)。

1.2模型制備5組幼鼠在氯胺酮復合麻醉劑麻醉狀態(tài)下，在手術顯微鏡下，A組僅分離頸總動脈不結扎，B、C、D、E 4組分離左頸總動脈并結扎，均縫合切口。術后復蘇30 min將幼鼠放入37 ℃的恒溫密閉的缺氧箱中，以1 L/min的速度通入低氧氣體(體積濃度為8%的氧氣和92%的氮氣)2 h后取出，繼續(xù)保溫1 h后送回母鼠籠中自由飲食[2]。

模型成功判定方法采用Longa評分法進行神經行為學評定：1)無神經損傷癥狀為0分；2)不能完全伸展手術對側前爪或后爪為1分；3)行走時，向手術對側轉圈為2分；4)行走時，向手術對側傾倒為3分；5)不能自發(fā)行走，意識喪失為4分。將得分為2～3分的幼鼠視為成功模型。

1.3實驗方法

1.3.1頭針治療頭針選穴依據《頭針國際標準化方案》,選取頂顳后斜線、頂顳前斜線，根據華氏介紹的大鼠穴位圖譜[3]并模擬人體經穴定位。頂顳后斜線:“百會”至“曲鬢”(“百會”穴在頂骨正中點，“曲鬢”穴為耳緣直上與耳尖水平線的交點)；頂顳前斜線：頂顳后斜線向前平移0.1寸。直徑0.25 mm×25 mm毫針常規(guī)消毒,針體與皮膚成15°角至帽狀腱膜下。30 min/次，1次/d，期間捻轉3次，每次1 min,以200 r/min速度捻針。

1.3.2艾灸治療選穴百會、夾脊、足三里，參照標準同前。艾條溫和灸，5 min/穴，1次/d。

1.3.3頭針結合艾灸治療：上述頭針治療與艾灸治療同時進行。

1.4行為學測試幼鼠在術后16 d進行Y迷宮訓練,術后17 d進行Y迷宮試驗測定。Y迷宮訓練使幼鼠訓練至各個方向都能最終到達。參數(shù)調節(jié)：電壓50～60 V,延時5 s。實驗前先將幼鼠放入迷宮中適應3～5 min，然后以無規(guī)則次序變換安全區(qū)。幼鼠受電擊后逃到安全區(qū)后，燈光繼續(xù)作用10～15 s。然后，以幼鼠所在支臂就作為下一次測試的起始位置進行下一次測試。記錄幼鼠從打開燈到逃到安全區(qū)所需時間。每只檢測3次，取平均值,評定腦癱幼鼠學習記憶能力。

1.5免疫組化檢測于術后18 d分別取出各組幼鼠,10%水合氯醛腹腔麻醉，切開胸腔，心臟快速灌流生理鹽水100 mL，然后用4%多聚甲醛50 mL灌流固定。參照《大鼠腦立體定位圖譜》取前額2 mm至視交叉部位的腦片進行脫水、浸臘、包埋、切片、烤片、烘片、脫蠟、免疫組織化學染色。BDNF陽性反應定位在胞膜/胞漿,呈棕黃色或棕褐色。顯微鏡下(40×10倍)對每張切片任選5個不重疊視野進行攝像。測量每個視野內陽性細胞數(shù),再計算該切片平均陽性細胞數(shù)。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，多樣本計量資料進行單因素方差分析(ANOVA-one way)，方差不齊時，用近似F檢驗，兩兩比較采用LSD法。

2結果

2.1Y迷宮實驗結果各組反應時間明顯小于B組(P<0.01),C、D、E組之間比較，C組大于E組(P=0.39<0.05)，D組也大于E組(P=0.00<0.01),說明各治療組均能改善幼鼠的學習記憶能力，但以頭針結合艾灸組效果最好，見表1。

表1　各組幼鼠Y迷宮實驗結果

注：各組與B組比較，#P<0.01；C、D與E組之間比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.2BDNF基因蛋白陽性表達結果A組明顯小于B組(P=0.003<0.01),C、D、E組均明顯大于B組；治療組之間比較，C組小于E組(P=0.43<0.05)。

表2　各組幼鼠BDNF陽性表達結果

注：各組與B組比較，#P<0.01；C、D與E組之間比較，△P<0.05，△△P<0.01

3討論

研究表明，針灸治療能改善缺血性腦卒中患者的神經功能缺損程度,提高ADL和認知能力[4]。艾葉及其生成物具有清除自由基和過氧化脂質的作用，艾的燃燒生成物可附著在皮膚上并滲透進去，而起到治療疾病的作用[5]。針灸治療可促進腦電活動和神經遞質分泌，改善血液供應，改善腦細胞功能[6]。腦源性神經營養(yǎng)因子(BDNF)對腦損傷的影響是現(xiàn)在研究腦部疾病的一個熱點，廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)，對神經元的存活、分化、生長發(fā)育起著重要作用，并能防止神經元受損后死亡、改善神經元的病理狀態(tài)、促進受損傷神經元再生及分化等生物效應[7]。杜繼平[8]強調采用調和陰陽針刺法治療痙攣型腦癱，龍于飛[9]指出經筋的通利與否及督脈的氣血運行狀況與小兒腦癱的發(fā)生和發(fā)展有重要的關聯(lián)，通過理筋通督推拿法以醒神開竅可作為治療小兒腦癱的重要方法。劉振寰等[10]研究表明：神經生長因子注射能促進腦功能的代償作用，都為針刺治療腦癱提供了理論參考。

本研究為了探索頭針結合艾灸對缺血缺氧性腦損傷幼鼠學習記憶能力及腦內BDNF基因蛋白表達的影響，在中醫(yī)基礎理論的指導下，以頭針和艾灸作為干預手段，以缺血缺氧性腦損傷幼鼠為研究對象，對幼鼠的學習記憶能力綜合評定，對幼鼠BDNF陽性表達結果對比分析，把中醫(yī)的整體觀念、辨證論治應用到微觀的、具體的物質中去，深入探討針灸治療小兒腦癱作用機理。我們的研究發(fā)現(xiàn)，頭針、艾灸療法均可有效的改善HIBD幼鼠學習記憶能力，增強BDNF基因蛋白的表達，但以二者的聯(lián)合治療效果更佳，這與臨床治療小兒腦癱綜合療法優(yōu)于單一療法的臨床實踐一致。此外，頭針結合艾灸治療可以提高BDNF基因蛋白水平的表達并發(fā)揮其生物活性，從而保護中樞神經系統(tǒng)對抗自由基和抑制神經細胞凋亡，促進受損神經細胞功能恢復，進而促進神經功能缺損的恢復。這可能是頭針結合艾灸治療可以促進HIBD幼鼠學習記憶能力改善的機理之一。

參考文獻：

[1]凌蓉蓉.小兒腦性癱瘓的康復護理[J].吉林中醫(yī)藥,2007,27(10):40.

[2]VANNUCCI R C,VANNUCCI S J,Perinatal hypoxic-ischemic brain damage:evolution of an animal model[J].Dev Neurosci,2005,27(24):81-86.

[3]華興邦.大鼠穴位圖譜的研制[J].實驗動物與動物實驗,1991(1):1-5.

[4]張伯禮,王玉來,高穎,等.中風病急性期綜合治療方案研究與評價：522例臨床研究報告[J].中國危重病急救醫(yī)學,2005,17(5):259-263.

[5]朱志萍,王秀娟,王潔.頭針治療小兒腦癱的理論基礎初探[J].中國實用神經疾病雜志,2008,11(11):122-123.

[6]郭壯麗,裴海濤,韓迪,等.頭針對急性腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織髓過氧化物酶表達的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學,2010,22(4):240-241.

[7]Dunham J S,Deakin J F,Miyajima F,et al.Expression of hippocampal brain-derived neurotrophic factor and its receptors in Stanley consortium brains[J].Psychiatry research,2009,43(14):1175-1184.

[8]杜繼平.調和陰陽針刺法配合運動訓練治療痙攣型腦癱臨床觀察[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(1):53-54.

[9]龍于飛,吳云川.理筋通督推拿法論治小兒腦癱[J].吉林中醫(yī)藥,2010,30(11):969-971.

[10]劉振寰,祁巖超,潘佩光,等.針灸合神經生長因子對腦癱患兒腦功能代償?shù)挠绊慬J].中國針灸,2007,27(8):565-568.