■李晨曦 趙國芬

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

共軛亞油酸（conjugated linoleic acids,CLA）是指一組含有共軛雙鍵的亞油酸幾何位置異構(gòu)體。共軛亞油酸具有抗癌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗糖尿病、消除炎癥和抗肥胖等有益的功效[1]。但其在天然食品中的含量較低，如何獲得安全高效的生產(chǎn)方法顯得尤為重要。亞油酸異構(gòu)酶（linoleate isomerase,LA）是一種能夠催化亞油酸生成共軛亞油酸的酶，獲得高活性的亞油酸異構(gòu)酶是生產(chǎn)高活力、高純度共軛亞油酸的瓶頸。許多微生物體內(nèi)有亞油酸異構(gòu)酶，但這些微生物大多是厭氧菌，直接用這些微生物發(fā)酵生產(chǎn)CLA，條件難以控制；LAI為胞內(nèi)酶，產(chǎn)量低，且結(jié)合在細(xì)胞膜上，分離純化困難，制約了酶法生產(chǎn)CLA。所以，利用基因工程手段構(gòu)建高效表達(dá)亞油酸異構(gòu)酶基因的工程菌株[2]來獲得LAI顯得尤為重要。前人構(gòu)建的重組工程菌株中，以重組植物乳桿菌亞油酸異構(gòu)酶基因占多數(shù)，且大多數(shù)為原核表達(dá)系統(tǒng)[3]，表達(dá)的酶活也不十分理想。而酵母是低等真核生物，除具有大腸桿菌的生長快、易培養(yǎng)、遺傳操作簡單優(yōu)點(diǎn)外，還具有真核生物對蛋白質(zhì)的正確加工、修飾、以及空間折疊等功能，克服大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足。因此通過實(shí)驗(yàn)構(gòu)建酵母表達(dá)載體[4-6]，為進(jìn)一步轉(zhuǎn)化酵母工程菌實(shí)現(xiàn)體外表達(dá)提供了必要條件，并為將構(gòu)建高產(chǎn)CLA基因工程菌株大規(guī)模應(yīng)用在飼工業(yè)生產(chǎn)中奠定基礎(chǔ)[5]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和克隆載體質(zhì)粒

植物乳桿菌P-8(本實(shí)驗(yàn)室保存）、大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)（鴻之惠商貿(mào)有限公司）、酵母穿梭質(zhì)粒pKLAC1（上海捷瑞生物工程有限公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)大腸桿菌，胰蛋白胨1%,酵母提取粉0.5%,NaCl 1%,121℃高壓蒸汽滅菌20 min。滅菌后可室溫保存（如配制固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉于LB培養(yǎng)基中）。

MRS（Man Rogosa Sharp broth）培養(yǎng)基：用于培養(yǎng)植物乳桿菌P-8,酪蛋白胨1%,牛肉提取物1%，酵母提取物0.5%，葡萄糖0.5%，醋酸鈉0.5%,檸檬酸二銨0.2%，磷酸氫二鉀0.2%，吐溫-80 0.1%，七水硫酸鎂0.02%，十二水合硫酸錳0.005%，pH值6.8，121℃高壓蒸汽滅菌20 min（如配制固體培養(yǎng)基加入2%瓊脂粉于MRS培養(yǎng)基中)。

1.1.3 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶NotⅠ、XhoⅠ、蛋白酶K(購自于Takara）、Taq DNA聚合酶、T 4連接酶(購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司）、高純質(zhì)粒小量制備試劑盒、薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（均購自于上海捷瑞生物工程有限公司）。

TE緩沖液、1 M Tris-HCl(pH值6.8)、20 mg/ml溶菌酶、10%SDS、5 M NaCl、0.7 M CTAB/NaCl、酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1)、氯仿/異戊醇（24∶1）、異丙醇（預(yù)冷）、70%乙醇（預(yù)冷）。

1.1.4 引物

植物乳桿菌P-8 LAI基因序列利用Primer 5.0軟件，針對酵母載體pKLAC1的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對PCR擴(kuò)增引物（由上海捷瑞生物有限公司合成）：

上游引物P1：

5′-cgCTCGAGATGGTTAAAAGTAAAGCAATAT TGA-3′（下劃線為XholⅠ酶切位點(diǎn)）；

下游引物P2：

5′-cgGCGGCCGCTTAATCAAACATCTTCTTAGTT GC-3′（下劃線為NotⅠ酶切位點(diǎn)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物乳桿菌P-8總DNA的提取

采用CATB法提取。

1.2.2 植物乳桿菌LAI基因的PCR擴(kuò)增

以植物乳桿菌P-8的DNA為模板，進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，循環(huán)條件為：94℃變性30 s，54℃退火1 min，72℃延伸2 min；循環(huán)30輪后，72℃保溫10 min并終止反應(yīng)。產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并將目的條帶切膠回收試劑盒純化。

1.2.3 LAI基因PCR產(chǎn)物的克隆及鑒定

凝膠回收的LAI基因連接到pMD19-T載體上，熱沖擊法轉(zhuǎn)化氯化鈣法制備的感受態(tài)E.coli DH5 α，對陽性克隆用菌落PCR、XholⅠ與NotⅠ雙酶切和序列分析進(jìn)行鑒定。

1.2.4 LAI酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

pKLAC1質(zhì)粒和重組質(zhì)粒pMD19T-LAI進(jìn)行XholⅠ、NotⅠ雙酶切，將從pMD19T-LAI切下的LAI基因連接到酶切后的表達(dá)載體pKLAC1上。

1.2.5 乳酸克魯維酵母感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化

采用電擊法制備酵母感受態(tài)細(xì)胞；采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒。

1.2.6 陽性轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定[7]

采用菌落PCR的方法和序列分析鑒定陽性轉(zhuǎn)化子。

2 結(jié)果

2.1 亞油酸異構(gòu)酶基因的PCR擴(kuò)增

以Lactobacillus.P.P-8的基因組DNA為模板通過PCR擴(kuò)增LAI，經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到1 700 bp的片段（見圖1），與預(yù)期大小相同。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

2.2 鑒定重組質(zhì)粒pKLAC1-LAI

經(jīng)過菌落PCR用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，有目的條帶的菌液在含100 μg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。對培養(yǎng)到呈渾濁的菌液進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取，提取后的質(zhì)粒再通過XhoⅠ與NotⅠ雙酶切反應(yīng)，進(jìn)行0.7%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到1 700 bp片段（見圖2、圖3），成功構(gòu)建重組表達(dá)載體。

圖2 菌落PCR鑒定

圖3 雙酶切鑒定

2.3 測序鑒定

挑取白色陽性克隆菌株，經(jīng)PCR鑒定含有目的片段的單菌落與液體YPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，菌液送上海捷瑞生物有限公司測序，測序結(jié)果如上，經(jīng)DNAMAN軟件進(jìn)行序列比對，與保守序列相似度達(dá)99.9%。

3 討論

共軛亞油酸具有很多功能，其中研究較為突出的有：抗癌、抗動(dòng)脈粥樣化、延緩機(jī)體免疫力衰退、減肥等功能。本試驗(yàn)構(gòu)建了植物乳桿菌P-8來源的亞油酸異構(gòu)酶基因乳酸克魯維酵母工程菌株[8-9]，這是國內(nèi)首次從Lactobacillus.P.P-8克隆出亞油酸異構(gòu)酶基因并在乳酸克魯維酵母中得到分泌表達(dá)，不僅簡化目的蛋白分離純化過程[10-11]，還能有效防止被胞內(nèi)蛋白降解，為大規(guī)模應(yīng)用到飼料工業(yè)中提供必要條件[12]；為進(jìn)一步將該基因引入可食微生物菌體產(chǎn)生CLA，開發(fā)保健功能性食品提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)。