疏風宣肺方和解表清里方體外干預甲型流感病毒H1N1誘導炎性細胞因子分泌作用的研究※

葛世杰劉曉婷張沂盧娜娜顧立剛△吳珺邱澤計張洪春1晁恩祥1

(北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院中醫(yī)藥抗病毒重點實驗室，北京100029)

【摘要】目的研究疏風宣肺方和解表清里方對甲型流感病毒H1N1感染的人肺腺癌上皮細胞(A549)中炎性細胞因子的影響。方法培養(yǎng)A549，甲型流感病毒H1N1感染A549后，分為細胞對照組、H1V1感染組、奧司他韋對照組、疏風宣肺組及解表清里組。采用實時定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和Western blotting法檢測各組細胞中炎癥相關的白細胞介素(IL)1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、調節(jié)活化正常T細胞表達和分泌的趨化因子(RANTES)的mRNA及蛋白表達的變化。結果基因芯片結果提示，與細胞對照組比較，H1N1感染組差異表達基因Il1β、Thf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2明顯上調。與H1N1感染組比較，奧司他韋組、疏風宣肺組和解表清里組差異基因Thf、Il1β、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2表達顯著下調。RT-PCR結果顯示，與細胞對照組比較，H1N1感染組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA表達均顯著升高(P<0.01)。與H1N1感染組比較，疏風宣肺組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1的mRNA表達均明顯降低(P<0.01，P<0.05)，解表清里組IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA表達均明顯降低(P<0.01，P<0.05)。Western blotting結果顯示，H1N1感染組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達較細胞對照組顯著升高(P<0.05)；與H1N1感染組比較，疏風宣肺組及解表清里組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。結論疏風宣肺方和解表清里方均可抑制流感病毒感染后炎性細胞因子IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA過表達及蛋白分泌，減輕炎癥反應，并恢復機體免疫功能的穩(wěn)定和平衡。

【關鍵詞】流感病毒A型，H1N1亞型；抗病毒藥(中藥)；炎癥趨化因子類；體外研究；基因表達調控，病毒

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.06.024

【中圖分類號】R373.13；R978.7；R349.64；R9-33；R392.114

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)06-0863-05

通訊作者：△北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院醫(yī)學病原學系，北京100029

作者簡介：葛世杰(1981—)，男，醫(yī)師，博士研究生在讀。研究方向：中醫(yī)藥抗流感免疫學和分子生物學研究。

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of Shufeng-xuanfei and Jiebiao-qingli formulae on inflammatory cytokines induced by virus H1N1 in human pulmonary carcinoma cell A549. MethodsHuman pulmonary epithelial cells A549 were cultured and infected by influenza virus H1N1，and were divided into cell control group，H1N1-infected group，oseltamivir group，Shufeng-xuanfei group and Jiebiao-qingli group. The mRNA and protein expression of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES were detected by DNA microarray，real-time PCR and western-blotting. ResultsGene microarray showed that，as compared with cell control group，the expressions of Il1β，Tnf，Ccl5，Il10，Il6，Ccl2 were obviously up-regulated in H1N1-infected group. Compared with H1N1-infected group，the expressions of Il1β，Tnf，Ccl5，Il10，Il6，Ccl2 were obviously down-regulated in oseltamivir group，Shufeng-qingre group and Jiebiao-qingli group. RT-PCR showed that，as compared with cell control group，the mRNA expressions of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES were significantly increased in H1N1-infected group (P<0.01). Compared with H1N1-infected group，the mRNA expressions of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10 and MCP-1 were significantly decreased in Shufeng-xuanfei group (P<0.01，P<0.05)，and the mRNA expressions of IL-1、TNF-、IL-6、MCP-1 in Jiebiao-qingli group were significantly decreased (P<0.01，P<0.05). Western blotting showed that，the levels of L-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES in H1N1-infected group were obviously increased as compared with those in cell control group (P<0.05). The levels of IL-1，TNF-α，IL-6，IL-10，MCP-1 and RANTES in Shufeng-qingre and Jiebiao-qingli group were decreased as compared with those in H1N1-infected group (P<0.05，P<0.01). ConclusionShufeng-xuanfei formula and Jiebiao-qingli formula can down-regulate the over-expressions of IL-1，TNF-α，IL-6，MCP-1 and RANTES mRNA and protein，reducing inflammation，restoring stability and balance of body's immune function.

收稿日期：(2014-12-31)

※項目來源：國家自然科學基金資助項目(編號：81173371)

1北京中日友好醫(yī)院呼吸內科，北京100029

Investigation of extraorgan intervention of combination of Shufeng-xuanfei formula and Jiebiao-qingli formula on the secretory action of influenza virus H1N1-induced inflammatory cytokinesGEShijie，LIUXiaoting，ZHANGYi，etal.KeyLaboratoryofChineseMedicineonViralDisease，BasicMedicalCollege，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029

【Key words】Influenza virus type A，H1N1；Antiviral agent (Traditional Chinese medicine)；Chemokines；In vitro study；Gene expression regulation；Virus

人流感病毒分為甲(A)、乙(B)、丙(C)3型，其中甲型流感病毒抗原性易發(fā)生變異，多次引起世界性大流行[1]。盡管世界衛(wèi)生組織(WHO)已在2010-08宣布甲型H1N1流感流行已經過去，但每年季節(jié)性流感流行及某時某種新型流感的出現仍會嚴重威脅人類健康[2]。近年來，隨著中醫(yī)藥對流感病因病機、作用靶點等研究的不斷深入，傳統中醫(yī)藥在治療流感方面取得了滿意療效，表現出獨特優(yōu)勢。其中，中藥對流感病毒感染機體免疫調控網絡中的炎性細胞因子的干預研究成為熱病微觀化研究的熱點之一[3]。疏風宣肺方和解表清里方是根據中醫(yī)“外感風寒，內蘊熱毒”的病機理論，結合長期臨床實踐配伍而成。本實驗研究通過動態(tài)觀察2種不同治法方藥對甲型H1N1流感病毒感染所致人肺腺癌上皮細胞(A549)炎癥性細胞因子的影響，探討其治療流感的藥效學機制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗試劑及儀器A549，購自中國醫(yī)學科學院細胞中心。McCoy's 5A培養(yǎng)基和胎牛血清，美國gibco公司；0.25%胰酶-0.02% 乙二胺四乙酸(EDTA)，美國Thermo公司；細胞培養(yǎng)液(含10 %胎牛血清和1% 青-鏈霉素混合物的完全McCoy's 5A培養(yǎng)基)，細胞維持液(含2.0%胎牛血清的McCoy's 5A培養(yǎng)基)，1.5%雞紅細胞混懸液；聚合酶鏈式反應(PCR)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；逆轉錄酶(M-MLV)反轉錄試劑盒，TaKaRa公司；實時定量PCR(RT-PCR)擴增試劑盒，購自北京澤平科技有限責任公司；100 bp DNA ladder，購自北京全式金生物技術有限公司；基因芯片檢測試劑盒(Ambion 8AM1753)，CA，USA；基因芯片HOA 5.1，Phalanx Biotech Group，Inc，Taiwan；One Array?預雜交緩沖液[5XSSPE，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，1%牛血清白蛋白(BSA)]；掃描儀AXON4000B，Molecular Device，CA，USA；軟件Rosetta Resolver?System，Rosetta Biosoftware，USA。白細胞介素(IL)1、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、IL-10、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、調節(jié)活化正常T細胞表達和分泌的趨化因子(RANTES)，一抗購自北京博奧森生物技術有限公司，二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司，蛋白質分子量Marker購自美國Biorad。

1.1.2流感病毒甲型流感病毒H1N1，A1/黔防/166/85株，中國中醫(yī)科學院中藥研究所提供，長期低溫(-76 ℃)保存?zhèn)溆?。?日齡雞胚尿囊腔連續(xù)傳代2次后，病毒原液血凝滴度為1∶128，組織培養(yǎng)感染劑量(TCID)50=10-3.778。

1.1.3實驗藥物疏風宣肺方由金銀花、連翹、牛蒡子、蟬蛻、荊芥、大青葉、淡豆豉、板藍根、生甘草等組成；解表清里方由炙麻黃、生石膏、黃芩、杏仁、生甘草、紫蘇葉、荊芥、獨活、桔梗等組成。均由中日友好醫(yī)院藥廠經選料—去雜—工業(yè)提取—濃縮—干燥—制粒成顆粒，疏風宣肺方每包6.2 g，解表清里方每包7.3 g。磷酸奧司他韋膠囊(達菲，瑞士巴塞爾豪夫·邁羅氏有限公司，進口藥品注冊證號H20090377，分裝批號SH0037)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)A549加細胞培養(yǎng)液經3~4次傳代后，細胞恢復正常生長周期。將生長狀態(tài)良好的細胞加入0.25%胰酶-0.02% EDTA消化細胞，洗脫后加入細胞培養(yǎng)液，調整細胞濃度為1.5×105/ mL，接種于60 mm培養(yǎng)皿中，在37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使細胞呈單層貼于孔底。取增殖旺盛、狀態(tài)良好的細胞用于實驗。

1.2.2分組將培養(yǎng)的細胞分為5組，即細胞對照組(N組)、H1N1感染組(M組)、奧司他韋對照組(D組，濃度0.75 μg/mL)、疏風宣肺組(S組，濃度2.5 μg/mL)、解表清里組(J組，濃度2.5μg/ mL)，每組8孔。除細胞對照組外，其余4組均用流感病毒H1N1吸附2 h后，H1N1感染組小心吸棄各孔病毒液，換用維持液繼續(xù)培養(yǎng)；奧司他韋對照組、疏風宣肺組及解表清里組棄掉病毒液，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次后，分別加入相應濃度藥物作用24 h后棄去上清，PBS清洗1次后，加入細胞裂解液，置-80 ℃冷凍過夜，待檢。

1.2.3基因芯片分析芯片實驗由華聯生物科技股份有限公司完成，包括3次生物學重復。在樣本中提取各組細胞總mRNA后，在收集的樣本中提取細胞總RNA，定量并鑒定其完整性，保證沒有降解。RNA首先被反轉錄合成cDNA，用熒光染料Cy3和Cys雙色熒光標記，檢定熒光強度和標記效率，芯片雜交及掃描，實驗重復3次，計算探針信號在各組與H1N1感染組的強度比值。查找基因信息功能及生物路徑，篩選出炎癥通路相關的差異表達基因。各組探針訊號的強度比值以log2(比值)表示。與H1N1感染組比較，log2(比值)>1，表示顯著上調的表達基因；log2(比值)<-1，表示顯著下調的表達基因。

1.2.4RT-PCR檢測提取各組細胞總mRNA后，進行反轉錄。按試劑盒說明進行PCR反應。RT-PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳。將凝膠置于紫外自動成像系統，啟動自動分析軟件，記錄目的基因擴增條帶的灰度值，并分別計算內參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)值與各樣本目的基因比值，統計目的基因表達的相對量，采用2-ΔΔCT方法計算[4]。

1.2.5Western blotting法檢測相關蛋白表達收集細胞提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度。樣品上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，半干電轉膜儀轉膜。封閉后加入IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES一抗，4 ℃過夜。洗膜3次，加入漂洗液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗，振蕩。將聚偏二氟乙烯(PVDF)膜于室溫下振蕩溫育。增強化學發(fā)光法(ECL)顯色，X線膠片曝光，經顯影、定影、掃描后觀察結果。應用 Image-Pro Plus 軟件對掃描圖像的目的條帶進行吸光度分析各目的條帶與GAPDH的吸光度比值為目的蛋白的相對表達量。

2結果

2.15組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA轉錄水平比較見表1。

表1　5組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA轉錄水平比較 ± s

由表1可見，與細胞對照組比較，H1N1感染組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA表達均顯著升高(P<0.01)。與H1N1感染組比較，疏風宣肺組的IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1的mRNA表達均明顯降低(P<0.05，P<0.01)，解表清里組IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA表達均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。奧司他韋組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA表達均明顯降低(P<0.01)。

2.2甲型流感病毒H1N1感染A549后炎癥通路中基因轉錄的變化見表2。

由表2可見，與細胞對照組比較，H1N1感染組差異表達基因Il1β、Tnf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2明顯上調。與H1N1感染組比較，奧司他韋組、疏風宣肺組和解表清里組均對差異基因Il1β、Tnf、Ccl5、Il10、Il6、Ccl2的表達有顯著的下調作用。

表2　甲型流感病毒H1N1感染A549后炎癥通路中基因轉錄的變化

2.35組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達比較見圖1。

圖1　5組H1N1感染A549中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達比較

由圖1可見，H1N1感染組的IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達較細胞對照組顯著升高(P<0.05)。與H1N1感染組比較，疏風宣肺組、解表清里組及奧司他韋組IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES蛋白表達均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

3討論

流感屬中醫(yī)學“時行感冒”范疇，以外感風寒為外因，易入里化熱、內蘊熱毒為內因。臨床表現為咳嗽、頭痛、鼻塞、流涕、惡寒發(fā)熱、全身不適等癥狀。疏風宣肺方是以銀翹散為基礎方加減而成，既能疏風宣肺，又能清熱化痰，臨床上用于治療感冒屬風熱襲肺者。解表清里方是以麻杏石甘湯合防風通圣散為基礎方加減而成，既能發(fā)汗解表，又能清里熱，臨床上用于治療感冒屬風熱壅盛、表里俱實者[5]。前期體內實驗研究表明，疏風宣肺方和解表清里方可降低病毒性肺炎小鼠的肺指數，改善流感病毒感染小鼠肺組織病理損傷，有抗流感病毒的作用[6]。

為了更好地對比2種方藥的治療效果，本體外實驗觀察表明，流感病毒H1N1感染A549后，H1N1感染組細胞因子IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10、MCP-1、RANTES的mRNA和蛋白表達較細胞對照組均有上升趨勢，這可能與流感病毒感染后免疫應激有關。正常狀態(tài)下，流感病毒誘導并釋放流感病毒免疫炎性細胞因子，促進局部炎癥反應而發(fā)揮抗病毒作用。但當病毒毒力過強，免疫病理損傷是流感病毒感染后的重要致病機制，表現為促炎細胞因子IL-1、TNF-α、IL-6水平明顯升高，以及前炎癥因子 RANTES、MCP-1α、MCP-1過度釋放。疏風宣肺方和解表清里方干預后，IL-1、TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA和蛋白水平降低，病理損傷減輕，對靶器官有較強的免疫保護作用。同時，疏風宣肺方能降低IL-10高水平表達，抑制其與促炎因子發(fā)生的過度反應，提高炎性細胞因子對流感病毒刺激的反應性，增強和延長輔助性T2細胞(Th2)類細胞因子的產生，激活宿主免疫調節(jié)[7]。

疏風宣肺方和解表清里方多選用清熱解毒藥物組方，具有良好的抗炎和免疫調控作用。疏風宣肺方方中金銀花提取物可有效抑制甲型流感病毒FM1株體外增殖，對感染流感病毒雞胚具有預防和保護治療作用[8]；連翹可抑制甲型流感病毒核蛋白(NP)與病毒RNA結合形成NP復合物而阻礙流感病毒復制[9]；大青葉具有明顯的體外阻止H1N1流感病毒增殖作用[10]；板藍根能抑制TNF-α的過度表達[11]。解表清里方方中石膏、甘草、黃芩三藥合用，將“清、透、解”融為一體，清氣透邪解毒，使毒邪從上、從表而出，從而達到排除毒素、退熱，并治療流感的目的[12]。綜上所述，疏風宣肺方和解表清里方在體外均有直接抗炎、抗病毒作用，為下一步研究其抗流感病毒的作用機制和作用環(huán)節(jié)奠定了基礎。

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(本文編輯：曹志娟)