王艷麗 婁俊麗 杜遠(yuǎn)舉 李春力 程艷波

[摘要] 目的 了解鄭州地區(qū)秋冬季腹瀉患兒輪狀病毒（rotavirus，RV）G基因型。 方法 收集鄭州市第一人民醫(yī)院及鄭州人民醫(yī)院兒科門診及住院部2013年9月～2014年3月患兒的糞便標(biāo)本500份，采用膠體金法檢測(cè)RV抗原，陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因分型。 結(jié)果 500份標(biāo)本中，202份RV抗原陽(yáng)性，陽(yáng)性率為40.4%；陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行基因分型，G血清型以G1型（68.8%）為主要流行型別，其次為G3型（17.8%），G1和G3混合感染型（7.9%），G9型（1.5%）。 結(jié)論 鄭州地區(qū)A組RV以G1P8型為主，有混合感染型。

[關(guān)鍵詞] 輪狀病毒；基因型；腹瀉；嬰幼兒

[中圖分類號(hào)] R725.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）33-0045-03

自1973年澳大利亞學(xué)者Bishop等首次發(fā)現(xiàn)輪狀病毒（Rotavirus，RV）以來(lái)，人們對(duì)RV的研究越來(lái)越深入。5歲以下的嬰幼兒大部分感染過(guò)RV腸炎[1]。在發(fā)展中國(guó)家，小兒腹瀉常常是嬰幼兒死亡的主要原因，僅次于肺炎，排在第二位[2]。大約90%的RV感染相關(guān)死亡病例發(fā)生在亞洲和非洲的發(fā)展中國(guó)家[3]。我國(guó)每年有4萬(wàn)嬰幼兒因RV性腹瀉而死亡[4]。RV型別多，易變異，人群普遍易感。因此，不同地域RV流行特征明顯不同，同一地區(qū)不同季節(jié)型別也不同，甚至同一地方同一種型別也可能存在多種毒株同時(shí)流行[5]。因此有必要建立廣泛的RV監(jiān)測(cè)網(wǎng)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)RV流行株的變化，從而為疫苗研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。鄭州屬溫帶氣候，是我國(guó)RV流行的代表性地區(qū)之一。為了解鄭州地區(qū)秋冬季RV基因型別，為RV疫苗的研制以及臨床應(yīng)用提供依據(jù)，本研究收集鄭州市第一人民醫(yī)院及鄭州人民醫(yī)院兒科2013年9月～2014年3月500份門診及住院部腹瀉患兒的糞便標(biāo)本，進(jìn)行G基因型分型，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2013年9月～2014年3月鄭州市第一人民醫(yī)院及鄭州人民醫(yī)院兒科門診及住院腹瀉患兒標(biāo)本500份，其中女193例，男307例，年齡在5歲以下，具體臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2 RV檢測(cè)及提取試劑

膠體金法檢測(cè)RV，使用小量柱離心式/液體樣品RNA/DNA抽提試劑盒（購(gòu)自上海華舜工程有限公司）提取RVRNA。

1.3 RV的G分型

RT-PCR分別擴(kuò)增RV的VP7全長(zhǎng)基因，net-PCR進(jìn)行血清型分型。所用引物均有上海英駿生物基因工程股份有限公司合成，具體分型方法及引物見參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及直接計(jì)數(shù)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 輪狀病毒感染的年齡和性別分布

通過(guò)ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示：202份陽(yáng)性標(biāo)本中，男女性別無(wú)明顯流行病學(xué)特征。輪狀病毒感染患兒以6個(gè)月～1歲居多， 與其他年齡段比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1、2。

2.2 RVG血清型分型結(jié)果

對(duì)202陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行G基因分型研究，RVG血清型以G1型為主，并有不同的混合性感染病例。見表3。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于輪狀病毒腹瀉的研究較多。研究路線比較成熟。本研究對(duì)2013年9月～2014年3月鄭州地區(qū)腹瀉患兒進(jìn)行監(jiān)測(cè)RV陽(yáng)性率為40.4%，與2005年10月～2006年10月陽(yáng)性率相比51.97%[8]及2010年RV感染率50%相比有所下降[4]，低于國(guó)內(nèi)其他地區(qū)如烏魯木齊2007年RV感染率48.14%[9]、重慶地區(qū)2008年的50.69%[10]，與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)相比基本一致。

A組RV作為引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，主要感染人群為6個(gè)月～2歲的嬰幼兒，隨年齡增長(zhǎng)感染比例下降，考慮可能為年齡增長(zhǎng)兒童抵抗力增強(qiáng)有關(guān)。RV檢出率在男性患兒和女性患兒之間國(guó)內(nèi)報(bào)道各有區(qū)別。本研究顯示RV陽(yáng)性率在男女患兒之間無(wú)差異。

VP7為一種RV糖蛋白，是型特異性抗原，目前已有27個(gè)G血清型和35個(gè)P基因型被確定[11]。RV全球范圍內(nèi)最流行的組合為G1P8、G2P4、G3P8、G4P8、G9P8[12]。按照NCBI的分類標(biāo)準(zhǔn)VP7血清型有12個(gè)血清型（G1、G2、G3、G4、G5、G6、G8、G9、G10、G11、G12）和未能分型，其中5個(gè)（G1、G2、G3、G4、G9）型最為常見，且G9有增多趨勢(shì)[13]，并發(fā)現(xiàn)不常見的G9、G10等型別的出現(xiàn)。高志勇等[14]監(jiān)測(cè)北京地區(qū)2011年RV分子流行型別以G1+G9P8混合型為主。近年來(lái)河南省部分地區(qū)2005年、2006年、2010年鄭州地區(qū)監(jiān)測(cè)的流行株以G3為主相比流行株有所改變[4]。本研究發(fā)現(xiàn)2013年9月～2014年3月鄭州地區(qū)RV基因分型以G1型為主，也有G9型的出現(xiàn)。目前國(guó)內(nèi)也常有報(bào)道發(fā)現(xiàn)G9型輪狀病毒。并逐漸成為繼G1～G4之后第5種最為流行的血清型，本研究發(fā)現(xiàn)有混合感染株以及不常見的G9型，G9型較2010年比例有所增加，這是否與氣候、環(huán)境變化以及樣本量增多等因素有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

RV腹瀉的嚴(yán)重程度和RV血清型的相關(guān)性研究一直是個(gè)熱點(diǎn)。2013年WHO在關(guān)于RV疫苗的意見書中提出RV的型別通常與疾病的嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。本課題研究發(fā)現(xiàn)在所有研究的RV分型中合并呼吸道感染的病例G9型居多，這是否與RVG9型易合并呼吸道感染有關(guān)還是與G9型毒力強(qiáng)有關(guān)，需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

目前國(guó)際市場(chǎng)上銷售的RV疫苗為默克公司研制生產(chǎn)并于2006年上市的RV5疫苗（5價(jià)牛-人重組疫苗），商品名RotaTeq，主要預(yù)防G1～G4血清型RV引起的胃腸炎以及葛蘭素史克公司研制生產(chǎn)并于2008年上市的RV1疫苗（單價(jià)人RV疫苗），商品名Rotarix，主要預(yù)防由G1、G3、G4、G9導(dǎo)致的RV胃腸炎。在我國(guó)使用的是蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)的羊RV疫苗，該疫苗于1998年取得國(guó)家認(rèn)可并獲準(zhǔn)進(jìn)行試生產(chǎn)，2001年獲得國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的正式生產(chǎn)批件，投入使用安全有效。本研究還發(fā)現(xiàn)口服RV疫苗仍再次感染的情況，這說(shuō)明RV疫苗的使用并不能完全起到預(yù)防作用。具體原因有可能是與RV具有分節(jié)段的基因組，極易發(fā)生基因重配和基因重組甚至點(diǎn)突變有關(guān)[15]。目前越來(lái)越多的RV的型別流行的研制給疫苗帶來(lái)挑戰(zhàn)，理想的RV疫苗應(yīng)當(dāng)有很廣譜抗RV作用，且免疫性強(qiáng)無(wú)毒副作用。因此對(duì)RV流行病學(xué)的檢測(cè)意義重大。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Kalaf RN，Ghenghesh KS. Rotavirus in children with diarrhea in Tripoli[J]. Libyan J Med 2011，18（6）：6041-6042.

[2] Gemma Phillips，Ben Lopman，Laura C，et al. Asymptomatic rotavirus infections in England；prevalance，characteristics，and risk factors[J]. Am J Epidemiology，2010，171（9）：1023-1030.

[3] WHO. Rotavirus Vaccines. WHO position paper-January 2013[J]. Wkly Epidemiol Rec，2013，88（57）：49-64.

[4] 王奔，唐玉龍，王寧. 輪狀病毒疫苗研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際生物制品學(xué)雜志，2012，35（4）：178-181.

[5] 宋文萍，向文龍，俞守義. 廣州地區(qū)秋冬季腹瀉患兒輪狀病毒分子流行病學(xué)特征研究[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011， 27（4）：682-684.

[6] 程艷波，王艷麗. 2010年鄭州地區(qū)嬰幼兒腹瀉A組輪狀病毒VP7基因型分型[J]. 實(shí)用兒科臨床雜志，2011，26（7）：518-519.

[7] Leen-Jan Van Doorn，Bernhard Kleter，Evert Hoefnagel，et al.Detection and genotyping of human rotavirus VP4 and VP7 genes by reverse transcriptase PCR and reverse hybridization[J]. Journal of Clinical Microbiology，2009，47（9）：2704-2712.

[8] 王建陽(yáng)，沈曉晴，李夢(mèng)磊，等. 河南省嬰幼兒輪狀病毒腹瀉病原研究[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（5）：46-48.

[9] 廖烊，陳軍華，朱朝敏，等. 重慶嬰幼兒輪狀病毒分子流行病學(xué)特征及相關(guān)臨床資料分析[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，32（1）：77-80.

[10] 李玉靜，楊學(xué)磊，羅新輝，等. 烏魯木齊地區(qū)嬰幼兒腹瀉輪狀病毒分子流行病學(xué)研究[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2011，6（9）：641-643.

[11] Matthijnssens J，Ciarlet M，Mc Donald SM，et al. Uniformity of rotavirus strain nomenclature proposed by the Rotavirus classification working group（RCWG）[J]. Arch Viro，2011， 156（8）：1397-1413.

[12] 宗文萍，向文龍，俞守義，等. 廣州地區(qū)秋冬季腹瀉患者輪狀病毒分子流行病學(xué)研究特征[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2011，27（4）：682-684.

[13] Samajdar S，Chosh S，Chawla-Sarkar M，et al. Increase in prevalence of human group A rotavirus G9 strains as an important VP7 geno-type among children in eastern india[J]. J Clin Virol，2008，43（3）：334-339.

[14] 高志勇，李錫太，嚴(yán)寒秋，等. 2011年北京市5歲以下嬰幼兒A組輪狀病毒腹瀉監(jiān)測(cè)[J]. 國(guó)際病毒學(xué)雜志，2012，19（4）：153-155.

[15] 董慧瑾，錢淵. 嬰幼兒腹瀉相關(guān)的輪狀病毒分子流行病學(xué)最新研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際病毒性雜志，2009，16（2）：49-52.

（收稿日期：2015-05-04）