丹參酮ⅡA對壓力負荷增加大鼠心室膠原重構的影響※

趙智明常文靜趙凌杰董曉蕾沈思鈺蔡輝△

(中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結合科，江蘇南京210002)

【摘要】目的觀察丹參酮ⅡA對壓力負荷增加大鼠心室膠原重構的影響。方法采用腹主動脈縮窄術制備壓力負荷增加大鼠模型，動脈夾閉(其中8只大鼠不結扎腹主動脈，為假手術組)4周后，分為5組：假手術組、模型組、丹參酮ⅡA低劑量組[10 mg/(kg·d)]、丹參酮ⅡA高劑量組[20 mg/(kg·d)]及卡托普利組[100 mg/(kg·d)]組，每組各8只，各組均予相應藥液腹腔注射(卡托普利組為灌胃給藥)，連續(xù)給藥4周后檢測各組大鼠心臟質量指數(HWI)和左心室質量指數(LVWI)，蘇木精—伊紅(HE)染色法觀察左心室心肌病理學改變，Masson染色法觀察左心室心肌膠原形態(tài)，化學比色法測定心肌羥脯氨酸(HYP)含量。結果與假手術組比較，模型組大鼠HWI、LVWI、心肌組織HYP含量均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，心肌有不同程度的損害；與模型組比較，卡托普利組、丹參酮ⅡA高劑量組及丹參酮ⅡA低劑量組HWI、LVWI及HYP均明顯下降(P<0.01，P<0.05)，心肌損害均有不同程度改善。結論丹參酮ⅡA能夠抑制壓力負荷增加大鼠心肌膠原沉積和心肌HYP的表達，在一定程度可改善心室膠原重構。

【關鍵詞】心肌疾??；膠原；心室重構；疾病模型，動物；模型，動物；動物實驗；大鼠；丹參酮；丹參酮ⅡA；壓力負荷；膠原；心肌羥脯氨酸

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.04.026

【中圖分類號】R542.2；R965.1；R965.2；R285.5

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002-2619(2015)04-0550-04

通訊作者：△中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結合科，南京210002

作者簡介：趙智明(1979—)，男，主治醫(yī)師，碩士。從事中西醫(yī)結合基礎及臨床研究。

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of tanshinoneⅡA (TanⅡA) on ventricular collagen remodeling in rats with pressure overload increased.MethodsThe myocardial fibrosis rats with pressure overload increased were prepared with abdominal aortic constriction.These rats received abdominal aorta ligation for 4 weeks (8 rats of them didn' t ligate abdominal aorta, as sham operation group).The rats were divided into five groups : sham operation group, model group, Tan ⅡA of low dose group [L-TanⅡA group,10 mg/(kg·d)], Tan ⅡA of high dose group [H-Tan ⅡA group, 20 mg/(kg·d)] and captopril group[100 mg/(kg·d)],8 rats in each group.The corresponding medicine in each group was given by intraperitoneal injection(captopril group was given by intragastric administration), successive administration 4 weeks.After 8 weeks of surgery, heart mass index (HMI) and left ventricular mass index (LVMI) were detected, left ventricular myocardial histology were observed by HE staining, as well as left ventricular myocardial collagen forms by Masson staining, and ELISA for myocardial hydroxyproline (HYP) content.ResultsHMI, LVMI and myocardial HYP content in model group were significantly higher than those in sham operation group(P<0.05，P<0.01), and there were myocardial damage at different degree.Compared with model group, HMI, LVMI and myocardial HYP content in other three groups were obviously decreased (P<0.05，P<0.01), and there were improvement of myocardial damage at different degree.ConclusionTanshinoneⅡA can markedly inhibit myocardial collagen deposition and myocardial expression of HYP in pressure overload increased rats, and improve ventricular collagen remodeling in some extent.

收稿日期：(2013-07-25)

※ 項目來源：中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院科研基金面上項目(編號：2010Q027)

Effects of tanshinoneⅡA on ventricular collagen remodeling in rats with pressure overload increasedZHAOZhiming,CHANGWenjing,ZHAOLingjie,etal.DepartmentofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion,Jiangsu,Nanjing210002

【Key words】Myocardial diseases; Collagen; Ventricular remodeling; Disease model; Animal;Animal model;Animal experiment; Rat; Tanshinone；Tanshinone ⅡA

左心室肥厚是高血壓重要的靶器官損傷。研究發(fā)現，左心室肥厚不僅存在心肌細胞肥大，而且伴有心肌間質纖維化[1]。心肌間質主要由心肌成纖維細胞分泌的膠原纖維組成，對維持心臟正常的結構形態(tài)和生理功能起重要作用[2]。心肌纖維化是指心肌細胞外基質中膠原纖維過度聚集、膠原含量過度升高或膠原成分發(fā)生改變，可導致充血性心力衰竭、惡性心律失常和猝死，成為心室重構持續(xù)發(fā)展和難以逆轉的重要原因[3]。丹參酮ⅡA作為傳統(tǒng)中藥丹參的脂溶性有效成分，已被廣泛應用于臨床治療心血管疾病。研究已證實，丹參酮ⅡA能有效抑制大鼠心臟成纖維細胞增殖和表型轉化，減少細胞外基質產生，延緩心肌纖維化[4-5]，但其具體作用機制仍須進一步闡明。本研究通過腹主動脈縮窄術制備壓力負荷增加大鼠模型，觀察丹參酮ⅡA對大鼠心室膠原重構的影響，結果如下。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物清潔級6周齡Sprague Dawley(SD)大鼠60只，雄性，體質量160～200 g，動物合格證號：SCXK(軍)2007-2012，由中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動物實驗中心提供。動物飼養(yǎng)室溫為(23±3) ℃，周期光照8∶00～20∶00，飼料、墊料均高壓滅菌，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水。

1.1.2藥品及試劑丹參酮ⅡA磺酸鈉注射劑(上海第一生化藥業(yè)有限公司，國藥準字H31022558，2 mL∶10 mg)，卡托普利片(中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H31022986，12.5 mg/片)。羥脯氨酸(HYP)測定試劑盒，購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號KGT030-2。

1.1.3儀器賽多利斯電子天平(德國賽多利斯，型號E200)，病理組織切片機(美國Reichert HistoSTAT公司)，TS-8轉移脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號TS-8)，高速冷凍離心機(湖南湘依離心機儀器有限公司，型號SORVALL SHO3014)，紫外光度儀(SHIMADZU 公司，型號UV-visible Spectrophoto- meter)，分光光度計(SHIMAZDH公司，型號UV-2540)。

1.2方法

1.2.1模型制備采用Anversa P等[6]方法用腹主動脈縮窄術制備壓力負荷增加大鼠模型。大鼠適應性喂養(yǎng)5 d后，術前禁食12 h，自由飲水，將60只大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)行腹腔注射麻醉，固定，剃毛，常規(guī)備皮消毒后，于劍突下沿腹正中線逐層開腹，在腎動脈上方分離腹主動脈，在腎動脈上方0.5 cm用內徑0.70 mm銀夾夾閉，使腹主動脈縮窄60%～70%(8只大鼠不結扎腹主動脈)，確認無出血，將臟器復位后逐層關閉腹腔，術后6 h恢復飲食，予注射用青霉素鈉10萬U/kg肌肉注射抗感染3 d，觀察4周后分組。

1.2.2動物分組不結扎腹主動脈大鼠8只，為假手術組；取存活結扎腹主動脈大鼠32只，隨機分為4組，即模型組、丹參酮ⅡA低劑量組、丹參酮ⅡA高劑量組及卡托普利組，每組各8只。

1.2.3給藥方法假手術組及模型組大鼠予0.9%氯化鈉注射液4 mL/(kg·d)腹腔注射；丹參酮ⅡA低劑量組大鼠予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射劑10 mg/(kg·d)腹腔注射；丹參酮ⅡA高劑量大鼠予丹參酮ⅡA磺酸鈉注射劑20 mg/(kg·d)腹腔注射；卡托普利組大鼠予卡托普利片100 mg/(kg·d)灌胃。均連續(xù)給藥4周，觀察大鼠飲食、毛色、活動、水腫等一般性狀，每周稱體質量(BW)。

1.2.4觀察指標及方法

1.2.4.1心臟質量指數(heart weight index，HWI)和左心室質量指數(left ventricular weight index，LVWI)術后8周末，禁食12 h，將5組大鼠稱體質量后，采用10%水合氯醛溶液0.3 mL/100 g行腹腔注射麻醉，迅速開胸摘取心臟，于4 ℃0.9%氯化鈉注射液中洗去血液，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，稱取心臟質量(heart weight，HW)，再剪去左右心房、右心室游離壁，保留左心室及室間隔，稱取左心室質量(left ventricular weight，LVW)。分別計算HWI(HWI=HW/BW)和LVWI(LVWI=LVW/BW)。透壁剪取左心室心尖部分組織，投入液氮中保留待檢其他指標，其余標本放于4 ℃ 4%多聚甲醛中固定。

1.2.4.2病理形態(tài)學檢測心肌標本于多聚甲醛中固定24 h后，常規(guī)取材、脫水、石蠟包埋，沿左室長軸線每隔1 mm橫斷面切取數張4 μm厚切片，蘇木精—伊紅(HE)染色和Masson染色。光學顯微鏡觀察心肌組織形態(tài)學和膠原沉積改變。

1.2.5大鼠心肌羥脯氨酸(HYP)檢測心肌組織中HYP的含量可用于評估心肌組織中膠原水平，即心肌纖維化程度。采用化學比色法測定大鼠心肌組織中HYP含量，嚴格按照試劑盒說明書操作，心肌組織蛋白定量采用改良堿水法。

2結果

2.15組大鼠一般狀態(tài)術前60只大鼠，52只大鼠進行腹主動脈縮窄術，造模4周時，有20只死亡，主要死因為嚴重心力衰竭，至實驗結束時，未再出現大鼠死亡。假手術8只大鼠全部存活。術后第1 周，模型組、丹參酮ⅡA低劑量組、丹參酮ⅡA高劑量組及卡托普利組大鼠均精神萎靡，活動量減少，毛色暗淡，攝食及飲水減少，1 周后好轉。模型組大鼠6周后，精神萎靡，行動遲緩，倦臥，毛色逐漸失去光澤；而丹參酮ⅡA低劑量組、丹參酮ⅡA高劑量組及卡托普利組大鼠一般狀況較模型組有不同程度好轉。整個實驗期間，假手術組大鼠一般狀況良好，對外界刺激反應靈敏，行動敏捷，毛色光澤，攝食及飲水正常，與術前未見明顯差別。

2.25組大鼠HWI、LVWI及HYP比較見表1。

表1　5組大鼠HWI、LVWI及HYP比較　 ± s

與假手術組比較，*P<0.01；與模型組較，△P<0.05，△△P<0.01

由表1可見，與假手術組比較，模型組HWI、LVWI及HYP均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組、丹參酮ⅡA高劑量組及丹參酮ⅡA低劑量組HWI、LVWI及HYP均明顯下降(P<0.01，P<0.05)。

2.35組大鼠心肌組織病理學結果

2.3.1HE染色光鏡下觀察可見，假手術組大鼠心肌纖維排列整齊，橫紋明顯，胞核結構清晰，無細胞腫脹，心肌間質及微血管結構正常(見封3，圖1)；模型組大鼠心肌纖維明顯增粗，排列紊亂，部分心肌細胞水腫、淺染，橫紋模糊，偶見心肌斷裂，肌束間隙呈不同程度增大，細胞核固縮，部分出現局灶性、片狀壞死，間質可見炎性細胞浸潤(見封3，圖2)；而卡托普利組、丹參酮ⅡA高劑量組及丹參酮ⅡA低劑量組心肌損害均較模型組有不用程度改善(見封3，圖3-5)。

2.3.2Masson染色光鏡下觀察可見，假手術組大鼠小動脈周圍有少量膠原沉積，但很少向周圍間質延伸，心肌間質內膠原多呈散在或長條索狀分布(見封3，圖6)；模型組大鼠血管周圍及心肌間質膠原沉積均顯著增多，且交聯成網格狀(見封3，圖7)；而卡托普利組、丹參酮ⅡA高劑量組及丹參酮ⅡA低劑量組血管周圍及心肌間質膠原沉積均有不同程度減輕，卡托普利組及丹參酮ⅡA高劑量組膠原沉積減輕最明顯(見封3，圖8-10)。

3討論

延緩或逆轉心肌纖維化，改善心室重構可明顯改善心血管事件預后。心肌間質細胞外基質中膠原的堆積是引起心肌纖維化的主要原因，降低其合成及分泌可延緩或逆轉心肌纖維化。

腹主動脈縮窄大鼠模型是一種成熟的壓力負荷增加模型，不僅增加心臟后負荷，而且活化血管緊張素Ⅱ、醛固酮、內皮素1等神經體液激素[7]，與臨床相關性好。在手術后4周即形成心肌肥厚和心肌纖維化的病理改變[7-8]。本實驗結果發(fā)現，模型組大鼠HWI、LVWI及心肌HYP含量均顯著高于假手術組，而且病理學可見大量膠原纖維增生，表明壓力負荷增加，大鼠心肌膠原總量升高，造模成功。

丹參為唇形科植物丹參SalviamiltiorrhizaBge.的根，味苦、性微寒，入心、心包、肝經，具有活血調經、祛瘀止痛、涼血消癰、除煩安神的功效。丹參酮ⅡA是丹參中最豐富、結構最具代表性的丹參酮，能有效抑制大鼠心臟成纖維細胞增殖和表型轉化，減少細胞外基質產生，延緩心肌纖維化[4-5]，但其具體作用機制仍未明確。我們建立壓力負荷增加大鼠模型，并探討丹參酮ⅡA的作用機制發(fā)現，丹參酮ⅡA可抑制及逆轉壓力負荷增加大鼠的左心室肥厚狀態(tài)和纖維化。HWI和LVWI是反映心肌肥厚程度的重要指標。與假手術組比較，模型組大鼠HWI和LVWI明顯升高(P<0.01)，表明模型組大鼠已有明顯的心肌肥厚；而丹參酮ⅡA能顯著降低HWI和LVWI，表明其能抑制心肌肥厚，這與文獻報道

本實驗結果表明，丹參酮ⅡA能顯著減輕壓力負荷增加大鼠心肌細胞肥大，減少心肌膠原合成，降低心肌膠原含量，改善細胞外基質重塑，減輕心肌纖維化，并且這種作用與丹參酮ⅡA濃度呈一定相關性。

參考文獻

[1]Cuspidi C，Sala C，Zanchetti A.Management of hypertension in patients with left ventricular hypertrophy[J].Curr Hypertens Rep，2007，9(6)：498-505.

[2]Cuspidi C，Ciulla M，Zanchetti A.Hypertensive myocardial fibrosis[J].Nephrol Dial Transplant，2006，21(1)：20-23.

[3]Swynghedauw B.Molecular mechanisms of myocardial remodeling[J].Physiol Rev，1999，79(1)：215-262.

[4]張冬梅，秦英，牛福玲，等.丹參酮ⅡA對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞增殖及Ⅰ型膠原合成的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35(12)：1934-1936.

[5]蔡輝，趙智明，修春英，等.丹參酮ⅡA對溶血磷脂酸致新生大鼠心臟成纖維細胞增殖及分泌轉化生長因子β1的影響[J].醫(yī)學研究生學報，2008，40(3)：76-78.

[6]Anversa P，Olivetti G，Melissari M，et al.Morphometric study of myocardial hypertrophy induced by abdominal aortic stenosis[J].Lab Invest，1979，40(3)：341-349.

[7]董曉蕾，張群燕，趙智明，等.卡托普利對壓力負荷增加大鼠血漿血管緊張素Ⅱ、心鈉素及醛固酮水平的影響[J].微循環(huán)學雜志，2010，20(1)：5-6，10，封4.

[8]蔡輝，張群燕，趙智明，等.壓力負荷增加大鼠左心室重構模型的建立[J].醫(yī)學研究生學報，2010，23(2)：150-153.

[9]王平，陳少銳，王曉煒，等.丹參酮ⅡA抑制腎性高血壓大鼠氧化應激和心肌肥厚[J].中華高血壓雜志，2010，18(3)：229-234.

[10]Sugden PH，Clerk A.Cellular mechanisms of cardiac hypertrophy[J].J Mol Med (Berl)，1998，76(11)：725-746.

(本文編輯：曹志娟)

經 驗 交 流

方 藥 研 究