摘要：依據(jù)RNA干擾機制構(gòu)建多病毒基因靶向的RNA干涉雙元載體系統(tǒng)，為培育抗病毒復合侵染的番茄品種提供遺傳轉(zhuǎn)化載體。以煙草病毒?。═MV）、黃瓜花葉病毒（CMV）病毒外殼蛋白基因作為RNA干擾靶標基因，針對病毒株系間外殼蛋白基因同源區(qū)域設計靶序列引物，經(jīng)RT-PCR獲得兩段靶標基因的DNA靶序列。借助T載體將兩段靶序列連接成一條DNA序列。酶切后正向、反向錨定連接到pUCCRNAi中間載體的克隆位點，形成靶序列在載體中的雙向重復結(jié)構(gòu)；重復結(jié)構(gòu)酶切后插入含超強啟動子的pC2300-35s-OCS表達載體，重組的表達載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到只含輔助質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌中，完成RNAi雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建。

關(guān)鍵詞：煙草病毒?。═MV）；黃瓜花葉病毒（CMV）；番茄；RNA干涉；載體構(gòu)建

中圖分類號：Q789 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0759-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.054

Construction of RNA Interference Vectoer in TWO-Gene-Targeted of TMV and CMV

YIN Lei，TANG Kai-yue，ZHANG Yue-xin，LI You，LV Feng-xia

（College of Life Science and Technology， Mudanjiang Normal University， Mudanjiang 157012，Heilongjiang， China）

Abstract： On the basis of the RNA interference-mechanism，RNAi binary-vector system targeting virus gene was constructed， offering genetic transformation vector to tomato disease-resistance breeding. The coat protein gene of TMV and CMV was regarded as target-gene for RNA interference， designing the primers sequence according to the-homologous region of virus coat protein gene， cloning two sequences of TMV and CMV through RT-PCR and connecting into a sequence by T-vector. After enzyme digestion， bidirectional inserted into cloning sites of pUCCRNAi middle vector. After enzyme digestion， the repetitive structure inserted into pC2300-35s-OCS expression vector which containing super promoter. The recombinant expression vector plasmid electroporating into the Agrobacterium which containing the helper-plasmid. The binary vector system for RNAi has been constructed.

Key words： tobacco mosaic virus； cucumber mosaic virus； tomato；RNA interference； vectoer construction

番茄病毒病是由多種病毒單獨或復合侵染引起的病害[1]，以煙草病毒?。═MV）和黃瓜花葉病毒（CMV）為主要病源。病原物隨病殘體在土壤、種子中或其他宿根植物上越冬，生長階段通過蚜蟲、田間操作造成的傷口傳病。番茄病毒病是番茄上發(fā)生最普遍、最難防治、為害最嚴重的病害之一，一般減產(chǎn)20%～30%，影響番茄果實的食用價值，嚴重時甚至造成絕收[2]。目前，生產(chǎn)栽培中防治番茄病毒病常采取的方法有選育抗病毒番茄品種、接種弱毒株系誘導抗性、完善栽培技術(shù)、隔離傳毒蚜蟲等方法[3]。但抗病毒品種面對品種繁多且隨時突變的病毒存在抗性喪失的可能，其他措施屬規(guī)避病害發(fā)生，難以持久、有效地抵抗病毒侵染，病毒一旦發(fā)生，則無藥可治。生產(chǎn)中防治植物病毒病最有效的方法仍是培育抗病品種[4]。然而傳統(tǒng)的育種周期長，隨機性強，存在抗性資源單一，抗病譜系狹窄等局限。與傳統(tǒng)育種手段相比，采用分子手段育種能突破種間種質(zhì)資源限制，具有目的性強、周期短等優(yōu)點，為培育抗病毒新品種拓寬了途徑[5-8]。

RNA干涉（RNA interference，RNAi）是在研究線蟲時發(fā)現(xiàn)的一種現(xiàn)象[9]，其原理是外源或內(nèi)源生成的dsRNA被生物體內(nèi)某核酸酶切割成19～21個核苷酸的短雙鏈RNA（siRNA），與其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成RNA誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex， RISC）。RISC輔助siRNA反義鏈搜索靶基因mRNA上互補區(qū)域與之結(jié)合，定位切割引起降解，轉(zhuǎn)錄后基因沉默。載體構(gòu)建是RNAi技術(shù)應用的關(guān)鍵之一[10-13]。

本試驗依據(jù)RNAi原理，同時以TMV、CMV病毒外殼蛋白基因作為RNA干擾靶標基因，針對病毒株系間外殼蛋白基因同源區(qū)域[14]設計靶序列引物，經(jīng)RT-PCR獲得靶序列。介助T載體將兩段靶序列連成一條DNA序列做為RNAi的靶序列。酶切后正向、反向定位連接到pUCCRNAi中間載體的克隆位點上，構(gòu)建靶序列的反向重復結(jié)構(gòu)；重復結(jié)構(gòu)酶切后嵌入含超強啟動子的pC2300-35s-OCS表達載體，重組的表達載體質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化到只含輔助質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌中，完成雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建，為培育抗病毒復合侵染的番茄品種提供遺傳轉(zhuǎn)化載體。

1 材料與方法

1.1 材料

感染TMV和CMV病毒的煙草葉片、大腸桿菌DH5α菌液和農(nóng)桿菌LBA4404菌液由黑龍江省煙草科學研究所提供；pC2300-35s-OCS表達載體和pUCCRNAi中間載體由中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所提供；RNA提取試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T Vectoer、DNA回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶及連接酶為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖為Sigma公司產(chǎn)品；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的靶序列克隆及連接 Genbank中查找TMV病毒和CMV外殼蛋白基因序列，分析高度同源區(qū)域后設計靶序列引物，TMV病毒靶序列為267 bp，CMV病毒靶序列為219 bp，TMV-cp1引物5′端添加XhoⅠ酶切位點（用下劃線表示）。TMV-cp1：5′-ACTCGAGGCCCAACCCCTTCCAGC-3′；TMV-cp2：3′-CCCATTCAGGTCCTGCGTCTCG-5′；CMV-cp1：5′-GGAATCGGTATGGAGGAAAG-3′；CMV-cp2：5′-ACCCAAACAAGGGGAACAAC-3′。

田間采集感染TMV和CMV病毒的煙草葉片，提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA第一鏈；再以兩個靶序列特異引物分別進行PCR擴增，獲得目的基因靶序列，PCR產(chǎn)物分別連接到pMD18-T Vector 的EcoR V克隆位點（圖1），重組子轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基（Amp+）選擇擴繁提質(zhì)粒，特異引物PCR驗證連接正確，菌液送測序公司測序，所得序列經(jīng)NCBI網(wǎng)站BLAST比對，同源率達99%，產(chǎn)物命名為pMD18-T-TMV、pMD18-T-CMV。pMD18-T-TMV質(zhì)粒用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，在TMV靶序列左側(cè)切開，回收大于2 000 bp的片段，pMD18-T-CMV質(zhì)粒用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，切下CMV靶序列，回收近200 bp片段，回收產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化，經(jīng)LB液體培養(yǎng)基（Amp+）選擇擴繁提質(zhì)粒，以組合引物CMV-cp1/TMV-cp2 PCR驗證，產(chǎn)物命名為pMD18-T-TC，提取質(zhì)粒備用，完成兩個靶序列的連接。

1.2.2 RNAi中間載體構(gòu)建 采用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切pUCCRNAi載體和pMD18-T-TC重組子質(zhì)粒，pUCCRNAi載體回收大于2 000 bp片段，pMD18-T-TC重組子質(zhì)?；厥战?00 bp片段；連接轉(zhuǎn)化后LB選擇培養(yǎng)基（Kan+）選擇擴繁并提質(zhì)粒，PstⅠ單酶切驗證，連接產(chǎn)物命名為pUCCRNAi -TC1；pMD18-T-TC重組質(zhì)粒DNA再經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收近500 bp片段；pUCCRNAi-TC1載體重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和BglⅡ雙酶切，回收大于2 000 bp片段，利用同尾酶相同的粘性末端反向連接后轉(zhuǎn)化，LB選擇培養(yǎng)基（Kan+）選擇擴繁并提質(zhì)粒，PstⅠ單酶切驗證，連接產(chǎn)物命名為pUCCRNAi-TC2。

1.2.3 含靶序列反向重復結(jié)構(gòu)的表達載體構(gòu)建 重組子pUCCRNAi-TC2質(zhì)粒DNA經(jīng)PstⅠ單酶切回收近1 200 bp片段，pC2300-35s-OCS表達載體質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ酶切回收大于2 000 bp的片段，連接后轉(zhuǎn)化，LB選擇培養(yǎng)基（Kan+）選擇擴繁提質(zhì)粒，經(jīng)PstⅠ單酶切驗證，產(chǎn)物命名為pC2300-35s-OCS-TC，表達載體構(gòu)建完成，提取質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 雙元載體系統(tǒng)構(gòu)建 重組子pC2300-35s-OCS-TC表達載體質(zhì)粒，經(jīng)電擊法轉(zhuǎn)化到只含輔助質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌中，經(jīng)YEB液體培養(yǎng)基（Kan+）選擇擴繁，以組合引物CMV-cp1/TMV-cp2 進行菌液PCR驗證，有特異條帶的菌液擴繁后液氮速凍-80 ℃保存?zhèn)溆?，完成雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 TMV-cp和CMV-cp基因靶序列PCR驗證

pMD18-T Vector載體克隆位點如圖1所示。pMD18-T-TMV、pMD18-T-CMV特異引物PCR擴增后電泳分離結(jié)果如圖2所示。圖2結(jié)果表明，TMV的8個菌落PCR產(chǎn)物出現(xiàn)5條特異條帶，6號泳道最亮，CMV的PCR產(chǎn)物出現(xiàn)6條特異條帶，15號泳道最亮，6號和15號菌液測序結(jié)果證實序列正確。

pMD18-T-TMV和pMD18-T-CMV酶切后電泳分離結(jié)果如圖3所示，pMD18-T-CMV經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，切下CMV靶序列，pMD18-T-TMV經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ（TMV-cp1引物5′端添加）雙酶切，在TMV靶序列的左側(cè)切出斷口，SalⅠ和XhoⅠ屬同尾酶，CMV靶序列片段定位嵌入pMD18-T-TMV載體中TMV靶序列左側(cè)（圖1），連接后菌液經(jīng)組合引物（CMV-cp1/TMV-cp2）PCR，出現(xiàn)對應條帶（圖4），證實2個靶序列成功連接。

2.2 靶序列正向及反向嵌入RNAi載體酶切驗證

對pUCCRNAi載體質(zhì)粒和pMD18-T-TC重組子質(zhì)粒分別進行雙酶切，產(chǎn)物電泳分離結(jié)果如圖5所示?；厥债a(chǎn)物連接，pMD18-T-TC重組子經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，切下的CMV和TMV雙靶序列正向嵌入pUCCRNAi載體LB側(cè)的BamHⅠ和SalⅠ克隆位點（圖6），pMD18-T-TC重組子再次經(jīng)BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，CMV和TMV雙靶序列嵌入pUCCRNAi載體RB側(cè)的XhoⅠ和BglⅡ克隆位點，因為SalⅠ和XhoⅠ是一對同尾酶，BamHⅠ和BglⅡ是一對同尾酶，因此第二次嵌入是反向連接（圖6）。

第一次連接菌液質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ酶切驗證，結(jié)果擴增出700 bp特異條帶（圖7），證明正向定位連接正確；第二次連接菌液質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ酶切驗證，有1 200 bp特異條帶出現(xiàn)，證明反向定位連接正確（圖8）。

2.3 重組pC2300-35S-OCS-TMV表達載體PCR驗證、酶切驗證

pC2300-35S-OCS表達載體結(jié)構(gòu)如圖9所示。pUCCRNAi-TC2重組子和pC2300-35S-OCS表達載體質(zhì)粒PstⅠ酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖10所示。膠回收后連接，重組子pC2300-35S-OCS-TC質(zhì)粒經(jīng)PstⅠ單酶切驗證（圖11），4個質(zhì)粒酶切產(chǎn)物存在1 200 bp特異條帶，試驗證明表達載體構(gòu)建完成。

2.4 農(nóng)桿菌中靶序列重復結(jié)構(gòu)的檢測

電擊轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌，以CMV-cp1/TMV-cp2 組合引物進行菌液PCR驗證（圖12）。圖12表明，16個菌液中有9個菌液出現(xiàn)大于1 000 ～1 200 bp的特異條帶，條帶不是很亮，但足以說明靶序列重復結(jié)構(gòu)已轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。7號菌液擴繁后液氮速凍-80 ℃保存?zhèn)溆?，完成雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建。

3 小結(jié)與討論

本試驗多次應用了同尾酶，同尾酶是一類識別序列不同但產(chǎn)生相同黏性末端的限制性內(nèi)切酶，依靠同尾酶的特性，可以根據(jù)需要將不同的DNA片段進行靈活組合，拓寬了不同載體間酶切位點的應用。試驗過程中驗證農(nóng)桿菌中靶序列重復結(jié)構(gòu)時PCR特異條帶不是很亮。分析認為是靶序列DNA重復結(jié)構(gòu)在PCR反應時，變性后自身配對結(jié)合成穩(wěn)定的雙鏈，影響引物與模板結(jié)合。鑒于這種可能，試驗中利用克隆區(qū)域兩側(cè)相同的單酶切位點，采取質(zhì)粒DNA酶切驗證，最終證實了反向序列的存在。

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