摘要：以赤霞珠葡萄（Vitis vinifera L.）為材料，以Actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測葡萄果實(shí)發(fā)育過程中白藜蘆醇合酶（STS）基因表達(dá)量的變化，以期建立適于檢測該基因表達(dá)的RT-PCR試驗(yàn)體系。結(jié)果表明，在退火溫度58 ℃，擴(kuò)增循環(huán)31次的時(shí)候，STS基因能夠進(jìn)行較好的擴(kuò)增。在赤霞珠葡萄漿果發(fā)育的過程中，花后20、50 d STS基因表達(dá)量較少，在花后80 d表達(dá)量增到最大，花后110 d又降低。

關(guān)鍵詞：赤霞珠葡萄（Vitis vinifera L.）；白藜蘆醇合酶（STS）基因；半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）

中圖分類號：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0756-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.053

Study on the Expression of Resveratrol Synthase Gene by Semi-quantitative RT-PCR Method in Cabernet Sauvignon

ZHANG Xiao-li，QIN Chen-liang，DAI Hong-jun

（School of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021， China）

Abstract： With cabernet sauvignon（Vitis vinifera L.） grapes as test materials and Actin gene as an internal reference， the expression of resveratrol synthase （STS） gene in berries on grape fruit development process were detectined to establish an appropriate system of RT-PCR by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） method. The results showed that STS gene had a better amplification when the annealing temperature was equal to 58 ℃ and the number of amplification cycles was equal to 31 times. In the process of development of cabernet sauvignon berries， STS gene had a less expression on 20 days and 50 days after flowers， the maximum expression were found on 80 days after flowers， and then decreased on 110 days after flowers.

Key words： cabernet sauvignon grape （Vitis vinifera L.）； STS gene； RT-PCR

白藜蘆醇（Resveratrol，3，5，4-trihydroxytrans-stilbene，簡稱Res）是一種對人類健康有益的酚類化合物，日益受到廣大消費(fèi)者的青睞。研究表明，白藜蘆醇是含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物，具有順式和反式兩種構(gòu)象[1，2]。最早由日本科學(xué)家高岡道夫于1939年首次從毛葉藜蘆的根部獲得[3]。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇是治療炎癥和心臟疾病的有效成分[2]。1976年在葡萄屬植物中被發(fā)現(xiàn)，并被定性為一種抗毒素[4]。1997年美國科學(xué)雜志報(bào)道了白藜蘆醇在人類抗癌方面具有顯著功效[5]， 進(jìn)一步推動了白藜蘆醇代謝方面的研究，從而也實(shí)現(xiàn)從植物抗病領(lǐng)域研究向人類保健方面的過度。近年來，白藜蘆醇成為葡萄酚類物質(zhì)中研究最為廣泛的一種[1，6-9]。

本研究以赤霞珠葡萄（Vitis vinifera L.）為試驗(yàn)材料，對赤霞珠葡萄果實(shí)發(fā)育過程中白藜蘆醇合成酶STS基因的表達(dá)動態(tài)變化進(jìn)行檢測，旨在探討RT-PCR法檢測STS基因表達(dá)的可行性，為進(jìn)一步研究赤霞珠葡萄中白藜蘆醇的合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

赤霞珠葡萄來自賀蘭山東麓葡萄產(chǎn)區(qū)，寧夏大學(xué)葡萄與葡萄酒工程研究中心玉泉營試驗(yàn)基地。于2009年定植，試驗(yàn)地采用滴灌，管理水平中等，樹勢中等偏旺。

1.2 試劑

葡萄果實(shí)RNA提取試劑盒為OMEGA R6827-01 Plant RNA Kit，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為北京全式金生物有限公司生產(chǎn)的Trans Script One-Step gDNA Removal 和 cDNA Synthesis Super Mix， PCR擴(kuò)增試劑為北京全式金生物有限公司生產(chǎn)的2×Eco Taq PCR Super Mix（+dye）。

1.3 儀器

DW-86L828型Haier立式超低溫保存箱；梅特勒-托利多電子天平；TOMY SX-500型高壓滅菌鍋；Galanz p70D20TJ-D3型微波爐；DYY-6C型電泳裝置；精密性超純水儀；Nano Drop ND-1000型分光光度計(jì)；TECHNE Thermal Cycler -512型PCR儀；Xiangyi L-550型高速離心機(jī)。

1.4 方法

1.4.1 樣品采集 從葡萄盛花后20 d開始（7月2日），1個(gè)月采樣1次，最后一次是10月1日。選擇樹勢中等的葡萄植株30株標(biāo)記，從第二道和第三道鐵絲之間的果穗采樣， 每份樣品質(zhì)量為200～300 g。采集之后立即用錫紙包裹標(biāo)記，放液氮中速凍，-80 ℃超低溫保存。

1.4.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 試驗(yàn)所用的研缽先用酒精燈燒烤，然后用液氮預(yù)冷研磨樣品。藥匙、鑷子在200 ℃烘烤8 h滅菌備用。配制溶液所用的量筒，三角瓶121 ℃高壓蒸氣滅菌30 min，紫外通風(fēng)櫥里吹干備用?？俁NA的提取操作步驟按照OMEGA R6827-01 Plant RNA Kit說明書進(jìn)行。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。用紫外分光光度計(jì)檢測RNA的濃度，OD260 nm/280 nm要求在1.8～2.1范圍內(nèi)，OD260 nm/230 nm要求在1.0以上。進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)液的配置在冰上進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄的條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。

1.4.3 引物設(shè)計(jì) 半定量RT-PCR部分引物設(shè)計(jì)見表1。用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成引物。

1.4.4 PCR反應(yīng)條件 PCR體系參考2×Eco Taq PCR Super Mix（+dye）說明書，參照基因的引物合成說明書的TM，篩選最適合的退火溫度。

PCR擴(kuò)增程序：①STS基因。94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31次循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min。②Actin基因。94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1min，31次循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min。

1.4.5 半定量PCR體系的建立 以“1.4.2”獲得的cDNA為模板，分別用STS的序列特異性引物和Actin 內(nèi)參引物進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL，包括模板DNA 1.0 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，2×Eco Taq PCR Super Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霞珠葡萄RNA的提取

對提取的赤霞珠葡萄果實(shí)RNA進(jìn)行0.9%瓊脂糖凝膠電泳，上樣量為1 μL RNA+2 μL 6×Loading Buffer。從電泳結(jié)果（圖1）可以清楚看到，在18S、28S處出現(xiàn)目的條帶。同時(shí)，采用Nano Drop1 000檢測OD260 nm/280 nm，結(jié)果分別為1.92、1.96、1.90、1.95。表明所提取的RNA質(zhì)量符合要求。

2.2 PCR擴(kuò)增條件確定

依據(jù)2×Eco Taq PCR SuperMix（+dye）說明書以及引物合成說明書STS、Actin基因的TM值設(shè)定試驗(yàn)條件進(jìn)行梯度PCR。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖2、圖3、圖4所示。

從圖2中可以看出，退火溫度為54、56、58 ℃時(shí)，Actin基因有少量引物二聚體出現(xiàn)，無非特異性擴(kuò)增條帶；退火溫度在61～65 ℃范圍內(nèi)時(shí)有非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，無引物二聚體。

從圖3中可以看出，退火溫度為54、56、58、61、62、63 ℃時(shí)，STS基因均有非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，同時(shí)有少量引物二聚體出現(xiàn)。在61 ℃時(shí)，非特異性條帶最弱，引物二聚體也不是很清晰。

在圖2、圖3所得試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，縮小退火溫度差值，調(diào)整循環(huán)次數(shù)，繼續(xù)試驗(yàn)。從圖4中可以看出，擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為31時(shí)，STS基因的退火溫度在58 ℃時(shí)， Actin基因退火溫度在60 ℃時(shí)，均無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，可以使用。

2.3 STS 基因表達(dá)的半定量分析

以赤霞珠葡萄果實(shí)4個(gè)時(shí)期的cDNA為模板，利用STS、Actin基因的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳檢測到了預(yù)期大小的基因片段，131 bp的STS基因（圖5A）和200 bp Actin基因片段（圖5B）。電泳圖片條帶清晰，無非特異性擴(kuò)增帶出現(xiàn)。從圖5中可以看出，STS基因在花后20、50、110 d的條帶均較暗，在花后80 d條帶最亮，結(jié)果表明STS基因在赤霞珠果實(shí)發(fā)育的前期表達(dá)量較低（花后20、50 d），在花后80 d表達(dá)量最高，即在轉(zhuǎn)色期表達(dá)量最高，隨后又開始下降（花后110 d），即在果實(shí)成熟期表達(dá)量較低。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，適合STS基因半定量RT-PCR檢測的退火溫度為58 ℃。適合內(nèi)參基因Actin的退火溫度為60 ℃。在赤霞珠葡萄果實(shí)發(fā)育過程中，白藜蘆醇合酶STS基因的表達(dá)量前期呈逐漸增加的趨勢（花后20、50 d），在轉(zhuǎn)色期（花后80 d）達(dá)到最高值，然后成熟期（花后110 d）反而逐漸下降。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在赤霞珠葡萄果實(shí)生長發(fā)育時(shí)期中，白黎蘆醇含量呈積累增長，在成熟前期達(dá)到最高，趨于完熟時(shí)反而下降。這與馬遠(yuǎn)[10]的研究結(jié)果一致，而與段朝輝[6]的研究結(jié)果不同。這可能是由于研究所用的供試品種、葡萄生長環(huán)境等因素的差異不同造成的。

半定量PCR用于確定目的基因mRNA的表達(dá)量。通常以一個(gè)管家基因作為參照。傳統(tǒng)的方法是將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后使用等量的cDNA作為PCR模板，用特異引物進(jìn)行擴(kuò)增得到目的基因和管家基因的片段。由于不同組織或細(xì)胞等來源的目的基因表達(dá)量不同，在同一個(gè)PCR體系條件下擴(kuò)增得到的產(chǎn)物不同，而管家基因的表達(dá)則相同[11-13]。Reid等[14]曾經(jīng)從赤霞珠葡萄果實(shí)整個(gè)發(fā)育期的角度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明適宜用于定量PCR的內(nèi)參基因有GAPDH、Actin、EFI-α和SAND，本試驗(yàn)采用Actin作為內(nèi)參，研究白藜蘆醇合成關(guān)鍵酶STS基因，結(jié)果證明確實(shí)可行。已有的研究也表明，采用半定量RT-PCR法分析基因表達(dá)水平的影響因素較多，導(dǎo)致該法目前只能用于粗略比較樣品間的基因表達(dá)水平[15]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李曉東，李紹華，閆樹堂.葡萄白藜蘆醇研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào)， 2006，33（4）：836-838.

[2] 張 真.生物技術(shù)在白藜蘆醇研究中的應(yīng)用[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008（1）：119-125.

[3] 黃衛(wèi)文，黃壽恩，黎繼烈，等.白藜蘆醇的提取-檢測技術(shù)及其生物活性研究進(jìn)展[J].食品與機(jī)械，2010，26（6）：148-151.

[4] 毛俊霞.葡萄葉中白藜蘆醇的提取和分離純化研究[D].西安：陜西師范大學(xué)，2013.

[5] 余 興.葡萄果實(shí)生長發(fā)育過程中白藜蘆醇及其糖苷的HPLC測定[J].武漢植物學(xué)研究，2007，25（1）：84-88.

[6] 段朝輝.中國葡萄野生種白藜蘆醇含量分析的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2002.

[7] 楊星星.刺葡萄中白藜蘆醇及其衍生物的代謝積累與分離鑒定[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[8] 余 興.葡萄生育期及采后紫外處理后白藜蘆醇及其糖苷的變化研究[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[9] 李曉東.葡萄白藜蘆醇提取和HPLC定量測定適宜條件的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33（4）：836-838.

[10] 馬 遠(yuǎn).釀酒葡萄中白藜蘆醇的研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2003.

[11] 王 榮，李紅菊.半定量RT-PCR法在檢測基因表達(dá)水平中的應(yīng)用[J].阜陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，24（1）：49-52.

[12] 張 潔，張曉紅，張振海，等.半定量RT-PCR法檢測低磷脅迫下大豆根系質(zhì)膜H+-ATPase基因的表達(dá)[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（4）：53-56.

[13] 陳名紅.用半定量RT-PCR法分析基因表達(dá)水平的影響因素[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（8）：28-30.

[14] REID K E， OLSSON N， SCHLOSSER J， et al. An optimized grapevine RNA isolation procedure and statistical determination of reference genes for real-time RT-PCR during berry development[J]. BMC Plant Biology，2006，DOI：10.1186/1471-2229-6-27.