摘要：對已構(gòu)建的含β2毒素基因重組質(zhì)粒pETXB2進(jìn)行限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定，并用SDS-PAGE檢測不同培養(yǎng)條件下β2毒素基因的表達(dá)情況。經(jīng)酶切鑒定證實(shí)，pETXB2重組質(zhì)粒含有β2毒素基因而且閱讀框架和基因序列正確。同時(shí)采用IPTG誘導(dǎo)劑在改變培養(yǎng)基的pH、培養(yǎng)溫度、誘導(dǎo)劑的加入量及誘導(dǎo)時(shí)間4個(gè)方面對β2毒素基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，其最佳的表達(dá)條件是37 ℃，pH 7.0的培養(yǎng)基中，用終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，β2毒素蛋白的表達(dá)效果最好。

關(guān)鍵詞：C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；β2毒素基因；優(yōu)化表達(dá)

中圖分類號：S852；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0749-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.051

Abstract： An identification of recombinant plasmid pETXB2 containing β2-toxin gene was conducted with restriction endonuclease enzyme digestion， and the expression levels of β2-toxin gene under different cultural conditions were detected. By enzyme digestion identification， the recombinant plasmid pETXB2 contained β2-toxin gene and have positive reading frame. Meanwhile IPTG was adopted as inducer to regulate and control expression of the β2-toxin gene in four aspects of changing medium pH， culture temperature， amount of inducer， and inducing time. Results showed that， the optimal condition was the temperature 18 ℃， medium pH 7.0， final concentration 0.8 mmol/L IPTG， inducing time 4 hours， the expression effect of β2-toxin protein was optimized under the condition.

Key words：Clostridium perfringene type C； β2-toxin gene； optimal expression

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens） 是人類和動(dòng)物主要的病原體，可引起腸道和組織感染，是多種腸毒血癥、腸炎、食物中毒和氣性壞疽的主要病原菌之一[1-4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種革蘭氏陽性梭狀芽孢桿菌，可產(chǎn)生至少17種毒素，其中主要毒素為α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素，根據(jù)產(chǎn)生的毒素類型將其分為A、B、C、D和E 5種毒素型[5-8]。作為一種重要的病原體，產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于水和食物等各種環(huán)境，此外在人和多種動(dòng)物的腸道菌群中也普遍存在。產(chǎn)氣莢膜梭菌以芽孢和繁殖體形式棲居在土壤里，由于其能產(chǎn)生具有抵抗力的芽孢，已成為水污染重要的指示菌[9-11]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌所有的菌型均產(chǎn)生α毒素，B型和C型主要產(chǎn)生β毒素，B型和D型主要產(chǎn)生ε毒素，E型主要產(chǎn)生ι毒素[12]。研究人員一直認(rèn)為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的β毒素只有一種，但新近研究表明其可產(chǎn)生β1和β2兩種毒素，其中β2毒素是更重要的毒力因子，β2毒素與β1毒素及其他毒素均沒有顯著的氨基酸序列同源性，但與β1毒素具有相似的生物學(xué)活性，對于腸細(xì)胞都具有細(xì)胞毒性并且小劑量毒素即可導(dǎo)致小鼠死亡[13-15]。目前，鮮見國內(nèi)關(guān)于β2毒素基因克隆與表達(dá)調(diào)控的報(bào)道，本試驗(yàn)克隆了β2毒素基因并明確了其核苷酸序列，同時(shí)以IPTG為誘導(dǎo)劑和改變培養(yǎng)條件對β2毒素基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，實(shí)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)的最大化，從而為下一步大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)β2毒素基因工程亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

C型產(chǎn)氣莢膜梭菌強(qiáng)毒菌C59-44購自中國獸藥監(jiān)察所；受體菌JM109、BL21（DE3）、載體pET- 28c由吉林化工學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pGEM-T購自Promega公司。

1.2 試劑

質(zhì)粒提取試劑盒、Wizard PCR preps DNA Puri fication System、IPTG和TEMED購自Promega公司；限制性核酸內(nèi)切酶（NcoⅠ、BamHⅠ）購自Sigama公司；β-巰基乙醇、溶菌酶購自北京天根生物技術(shù)有限公司；卡那霉素（Kanamycin）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；過硫酸胺、N-N′-甲叉丙烯酰胺、丙烯酰胺購自華美生物公司；β2毒素抗血清購自中國獸藥監(jiān)察所。

1.3 β2毒素基因的擴(kuò)增

以提取的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌中國標(biāo)準(zhǔn)株C59-44基因組DNA為模板，根據(jù)Gibert[16]報(bào)道的β2毒素基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成一對引物（P1、P2）并分別引入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。P1：5′-CATGCCATGGCAAAAGAAATCGACGCTTAT-3′，P2：5′- CGCGGATCCTGCACAATACCCTTCACCAAA-3′（下畫線表示酶切位點(diǎn)）。按總體積25 μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中模板DNA 5 ng，Primer 0.1 μmol/L，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 200 μmol/L，MgCl2 2.5 μL，Taq DNA酶 2.5 U。程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 60 s， 47 ℃退火 60 s，72 ℃延伸 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.4 重組質(zhì)粒pETXB2的構(gòu)建及酶切鑒定

利用Wizard PCR preps DNA Purification System回收擴(kuò)增的β2毒素基因片段，產(chǎn)物經(jīng)Nco I/BamHⅠ酶切后與經(jīng)同樣酶切處理的表達(dá)載體pET-28c連接，構(gòu)建表達(dá)重組體pETXB2。反應(yīng)體系：pET-28c Vector 1 μL，10×T4 DNA酶 buffer 5 μL，T4 DNA酶 1.5 μL，PCR Product 2 μL，ddH2O 0.5 μL，14 ℃過夜。將連接反應(yīng)產(chǎn)物以CaCl2法轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3）中，取200 L菌液涂布于含卡那霉素LB瓊脂平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性菌落。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，并用聚乙二醇（PEG8000）法純化質(zhì)粒DNA，采用Nco Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切進(jìn)行鑒定。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析和ELISA檢測

按文獻(xiàn)[17]介紹的方法進(jìn)行。

1.6 IPTG對β2毒素基因的表達(dá)調(diào)控

1.6.1 確定β2表達(dá)最適pH 分別將LB液體培養(yǎng)基的pH調(diào)為6.5、7.0和7.5，每瓶10 mL分裝于3個(gè)50 mL錐形瓶中滅菌，每瓶加30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），37 ℃ 160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.6.2 確定β2表達(dá)最適溫度 將40 mL pH 7.0的LB液體培養(yǎng)基平均分裝于4個(gè)50 mL三角燒瓶中滅菌，并分別加入30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），分別于35、36、37、38 ℃ 160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4 h，離心收集菌體，SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。

1.6.3 確定β2表達(dá)最適IPTG誘導(dǎo)濃度 將40 mL pH 7.0的LB液體培養(yǎng)基平均分裝于4個(gè)50 mL三角燒瓶中滅菌，并分別加入30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）， 160 r/min，37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期，燒瓶中分別加入IPTG，調(diào)其濃度最終至0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L后，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物。

1.6.4 確定β2表達(dá)最適誘導(dǎo)時(shí)間 將40 mL pH 7.0的LB液體培養(yǎng)基平均分裝于4個(gè)50 mL三角燒瓶中滅菌，并分別加入30 μL 50 mg/mL的卡那霉素，然后接種1%的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），160 r/min，37 ℃恒溫培養(yǎng)至對數(shù)生長期，燒瓶中分別加入IPTG并調(diào)其濃度最終至0.8 mmol/L，分別培養(yǎng)1、2、3、4和5 h后，采用SDS-PAGE檢測表達(dá)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與分析

2.1 β2毒素基因的擴(kuò)增及pETXB2表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

利用PCR技術(shù)，以產(chǎn)氣莢膜梭菌中國標(biāo)準(zhǔn)株（C59-44）基因組DNA為模板，擴(kuò)增了0.72 kb β2毒素基因并連接到表達(dá)載體pET-28c，構(gòu)建了重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），提取pETXB2質(zhì)粒，NcoⅠ/BamH Ⅰ酶切鑒定證實(shí)其含有β2毒素基因片段，基因測序表明其閱讀框架正確（圖1），其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

2.2 β2毒素蛋白的SDS-PAGE分析

將構(gòu)建的重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）在37 ℃下培養(yǎng)，0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h后進(jìn)行SDS-PAGE分析（圖3），凝膠成像分析結(jié)果表明，β2毒素蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白含量的31%。

2.3 β2毒素蛋白ELISA檢測

超聲波裂解BL21（DE3）（pETXB2）菌體，對裂解物及陽性對照（β2毒素強(qiáng)毒菌C59-44）進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果表明，表達(dá)蛋白能夠被β2毒素抗體識別（表1）。

2.4 培養(yǎng)基pH對β2蛋白表達(dá)的影響

不同pH培養(yǎng)基明顯影響目的蛋白的表達(dá)，pH 7.0培養(yǎng)基培養(yǎng)，目的蛋白表達(dá)量最高，凝膠成像儀分析表明，目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對含量的30.2%（圖4）。

2.5 誘導(dǎo)溫度對β2蛋白表達(dá)的影響

誘導(dǎo)溫度對目的蛋白表達(dá)影響也比較大，37 ℃時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)量最高，凝膠成像儀分析結(jié)果表明，目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對含量的32.5%（圖5）。

2.6 IPTG誘導(dǎo)濃度對β2蛋白表達(dá)的影響

IPTG誘導(dǎo)濃度不同對目的蛋白表達(dá)量的影響也不同，終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)時(shí)目的蛋白表達(dá)量最高，凝膠成像儀分析結(jié)果表明，目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對含量的30.8%（圖6）。

2.7 誘導(dǎo)時(shí)間對β2蛋白表達(dá)的影響

隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，β2蛋白表達(dá)量也逐漸增加，當(dāng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后，目的蛋白表達(dá)量最高，凝膠成像儀分析結(jié)果表明，目的蛋白的表達(dá)量占菌體總蛋白相對含量的29.8%（圖7）。

綜上所述，重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）優(yōu)化表達(dá)條件是培養(yǎng)基pH 7.0、培養(yǎng)溫度37 ℃時(shí)，加入終濃度為0.8 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，此時(shí)表達(dá)效果較理想。

3 小結(jié)與討論

利用PCR擴(kuò)增技術(shù)，以產(chǎn)氣莢膜梭菌中國標(biāo)準(zhǔn)株（C59-44）基因組DNA為模板，擴(kuò)增了β2毒素基因并連接到表達(dá)載體pET-28c上，構(gòu)建了重組菌株BL21（DE3）（pETXB2），并證實(shí)其含有β2毒素基因表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)利用IPTG誘導(dǎo)對重組菌株BL21（DE3）（pETXB2）表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。外源基因在宿主菌中的表達(dá)涉及到宿主、載體和環(huán)境多種因素的影響。因此，通過改變一個(gè)因素來優(yōu)化多種影響因素從而使目的蛋白表達(dá)最大化。本研究通過固定其他參數(shù)來優(yōu)化單一因素，最終對影響目的蛋白表達(dá)量的多個(gè)關(guān)鍵因素實(shí)現(xiàn)最佳優(yōu)化。

本研究通過調(diào)控大腸桿菌pET表達(dá)系統(tǒng)上的乳糖（Lac）操縱子實(shí)現(xiàn)目的蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)劑通過開啟lacUV5啟動(dòng)子從而過量表達(dá)T7RNA聚合酶并最終產(chǎn)生大量目的蛋白。IPTG作為常規(guī)的誘導(dǎo)劑因不被菌體所利用且不會(huì)有復(fù)雜的代謝過程而被廣泛使用，但昂貴的價(jià)格和對菌體的毒性限制了其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用。所以為了降低IPTG對大腸桿菌代謝毒性并減少實(shí)際大規(guī)模生產(chǎn)中的費(fèi)用，有必要確定IPTG的最低有效濃度。本研究結(jié)果顯示，在終濃度為0.8 mmol/L時(shí)β2毒素蛋白表達(dá)量最大。溫度對表達(dá)產(chǎn)物的影響比較大，主要通過影響反應(yīng)過程中酶的反應(yīng)速率進(jìn)而影響蛋白性質(zhì)，當(dāng)37 ℃誘導(dǎo)時(shí)，β2毒素蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。pH明顯影響目的蛋白表達(dá)，當(dāng)培養(yǎng)基pH為7.0并振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，加入終濃度為0.8 mmol/L IPTG培養(yǎng)4 h，β2毒素蛋白表達(dá)量最高。誘導(dǎo)時(shí)間對蛋白表達(dá)影響也很大，在一定時(shí)期的誘導(dǎo)過程中，目的蛋白表達(dá)逐漸增加，達(dá)到最大值產(chǎn)量后，會(huì)隨著時(shí)間推移逐漸降解從而降低產(chǎn)量，結(jié)果顯示誘導(dǎo)4 h可使表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到最大化。本研究通過參數(shù)的改變從而使表達(dá)條件達(dá)到最佳，最終實(shí)現(xiàn)了目的蛋白表達(dá)的最大化，其最佳的表達(dá)條件是在37 ℃，pH 7.0的培養(yǎng)基中，用終濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h，β2毒素蛋白的表達(dá)效果最好。

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