摘要：為研究黑曲霉產(chǎn)果膠酶生物降解在再造煙葉所含果膠的含量，改善煙草薄片的品質，以河南中煙再造煙葉工藝生產(chǎn)線上的高濃混合漿為原料，采用單因素及正交試驗法對果膠酶降解果膠工藝條件進行優(yōu)化。結果表明，果膠降解最佳反應條件為酶活力為10 000 U/mL、料液比1∶1（g∶mL）、反應溫度50 ℃、處理時間3.0 h，果膠降解率達到最大，為29.26%±1.06%。高濃混合漿經(jīng)酶解后經(jīng)在線裂解氣相色譜/質譜法（PY/GC-MS）分析發(fā)現(xiàn)，裂解產(chǎn)物成分的組成、含量均發(fā)生了明顯的變化。酶處理前后醛酮類和雜環(huán)類化合物的相對含量分別增加2.03和1.96個百分點，酸類、酯類、萜烯類、苯環(huán)及酚類、醇類化合物的含量分別降低了0.50、1.17、0.80、1.32、0.04個百分點。對比裂解前后的產(chǎn)物的種類、數(shù)量與相對含量發(fā)現(xiàn)，利用黑曲霉產(chǎn)果膠酶降解高濃混合漿中的果膠，作用明顯。感官評價表明，酶解后的樣品添加于卷煙中，使得卷煙香氣更加柔和，刺激性減輕，透發(fā)性好，但香氣量略有不足。

關鍵詞：果膠降解；高濃混合漿；酶活力；降解率；熱裂解

中圖分類號：TS41 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0710-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.041

Abstract： In order to reduce the pectin content and improve the quality of reconstituted tobacco， high-concentrated mixed slurry from Henan Cigarette Industry Tobacco Sheet was used as raw material， the pectin degradation process conditions were optimized by single-factor and orthogonal test methods. The results showed that the optimum reaction conditions were pectin degradation enzyme activity 10 000 U/mL， the ratio of material to liquid 1∶1（g∶mL）， reaction temperature 50 ℃， time 3.0 h， pectin degradation rate reached the maximum， which was 29.26%+1.06%. After enzymolysis， the high-concentrated mixed slurry was analyzed by online pyrolysis gas chromatography/mass spectrometry（PY/GC-MS）， the composition and content of pyrolysis product were changed obviously， comparing with the control. The relative contents of aldehydes/ketones compounds and heterocyclic compounds prior to and after enzyme treatment were increased by 2.03 and 1.96 percentage points， respectively， the contents of carboxylic acids， lipids， terpenes， benzene （including phenols） and alcohols were decreased by 0.50， 1.17，0.80，1.32，0.04 percentage points， respectiverly. Compared with the compounds， quantity and the relative content of pectin content of the pyrolysis products prior to and after enzymolysis， it was found that Aspergillus niger pectinase has significant effect on reducing the pectin content of high-concentrated mixed slurry. Sensory evaluation showed that after the samples after enzymolysis were added to the cigarette， the aroma of the cigarettes became softer， less irritation， better permeability， but slightly less aroma amount than control.

Key words： pectin degradation； mixed tobacco pulp；enzyme activity；degradation rate； pyrolysis

造紙法煙草薄片是利用卷煙生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄料如煙末、煙梗為原料，采用不同的工藝萃取，將萃取后的煙末、煙梗經(jīng)打漿處理，從而獲得高濃度混合漿。然后再利用漿料制成紙，將萃取液合并經(jīng)過濃縮等手段處理后分兩次涂布到薄片片基上，得到成品煙草薄片[1]。由于煙草薄片的原料特殊性，其含有大量的纖維素、木質素及果膠等大分子物質。這些物質在高溫下均會產(chǎn)生稠環(huán)芳烴類化合物[2]。研究表明[3，4]，煙草果膠在燃吸過程中可產(chǎn)生甲醇，甲醇再進一步氧化為甲醛、甲酸等成分，不僅會給煙氣帶來刺激性，而且對人體有害。隨著生物技術的發(fā)展，國內外研究人員利用生物酶法來進行研究，以期減少煙草中的有害物質，改善卷煙吸味。于興偉等[5]用固態(tài)發(fā)酵方法研究了黑曲霉處理煙梗，降低煙草果膠的含量。劉耀飛等[6]考察了加酸性果膠酶量、料液比、pH、處理時間和溫度 5個因素對煙梗中果膠降解效果的影響。鄭小嘎等[7]通過在煙梗浸提過程中加入復合酶，降解煙梗中的大分子物質，改善吸味，減少刺激性。戴麗君等[8]利用酵母處理煙梗萃取液，降低糖含量，提高了煙草薄片的質量。

微生物發(fā)酵技術可以明顯改善煙草原料的化學組成特性[9]，為了改善煙草薄片的品質，本試驗以河南中煙再造煙葉工藝生產(chǎn)線上的高濃度混合漿為研究材料，利用黑曲霉SW06產(chǎn)出的粗果膠酶液為原料，優(yōu)化混合漿中果膠的降解條件。優(yōu)化培養(yǎng)液的使用比例、反應溫度、反應時間等參數(shù)，從而提高菌種的酶解能力，并對酶處理前后的樣品熱裂解產(chǎn)物進行分析，為微生物用于薄片生產(chǎn)過程中果膠的降解提供理論依據(jù)和方法借鑒[10]。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

樣品來自河南中煙再造煙葉工藝生產(chǎn)線上的高濃度混合漿。果膠粗酶液：黑曲霉液體培養(yǎng)2 d后離心去除菌絲體，并超濾濃縮發(fā)酵液，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

無水乙醇（天津市風船化學試劑有限公司）；濃硫酸、鹽酸、2 mol/L NaOH（開封市芳晶化學試劑有限公司）；D-半乳糖醛酸標準品（97%，Sigma-Aldrich公司）；0.15%咔唑溶液（天津市光復精細化工研究所）。

BS200S型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；UV-17001C型紫外分光光度計（上海鳳凰光學科儀有限公司）；HH-4型電熱數(shù)字恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；SPX-160B-2型恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲嶒炘O備有限公司）；CDSPYROPROBE2000型裂解儀（上海光譜儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 酶活力對果膠降解效果的影響 將不同酶活力（500、1 200、3 200、3 700、29 000、10 000 U/mL）的粗酶以料液比（混合漿∶粗酶液，g∶mL，下同） 1∶3的用量，均勻混入10 g混合漿中，50 ℃下，酶解2 h。酶解過程結束后將其放入70 ℃的烘箱中烘干，稱重，測定各處理樣品的果膠含量。

1.2.2 反應時間對果膠降解效果的影響 用酶活力為29 000 U/mL的粗酶液，料液比1∶3的用量處理10 g混合漿，50 ℃下，酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h。酶解后處理同“1.2.1”。測定各處理樣品的果膠含量。

1.2.3 料液比對果膠降解效果的影響 以料液比1∶1、1∶3、1∶5、1∶7、1∶9，酶活力為29 000 U/mL的粗酶液處理10 g混合漿，50 ℃下，酶解2 h。酶解后處理同“1.2.1”。測定各處理樣品的果膠含量。

1.2.4 反應溫度對果膠降解效果的影響 用酶活力為29 000 U/mL的粗酶液以料液比1∶3的用量處理10 g混合漿，分別在30、35、40、45、50、55 ℃下，酶解2 h。酶解后處理同“1.2.1”。測定各處理樣品的果膠含量。

1.3 正交試驗優(yōu)化

根據(jù)果膠降解的單因素試驗，結合果膠含量的測定結果，以酶活力、反應時間、料液比、反應溫度為分析因素，以測得的果膠含量為分析指標，選用L9（34）正交表對混合漿果膠降解條件優(yōu)化進行研究并進行差異顯著性分析，試驗因素和水平見表1。

1.4 檢測方法

1.4.1 果膠含量測定方法 將干燥后的樣品研碎，過250目篩，稱取10 g（精確到0.001 g） 樣品于燒杯中，用150 mL 0.05 mol/L加熱至沸騰的HCl溶液把混合漿樣品移入250 mL錐形瓶中，裝上冷凝器，于90 ℃水浴中加熱回流1 h，冷卻后把濾液移入250 mL容量瓶中，加入2 mol/L的NaOH中和至pH 4，搖勻。收集濾液即得總果膠提取液，備用[11]。

根據(jù)咔唑比色法測定果膠含量，以半乳糖醛酸為標準品。首先，移取1 mL待測液于6 mL濃硫酸的試管，搖勻，85 ℃水浴加熱15 min，取出冷卻，然后加入0.15%咔唑無水乙醇溶液0.3 mL，搖勻，暗置30 min。最后在530 nm下測定其吸光度。根據(jù)咔唑比色法標準曲線和以下公式求得待測液果膠含量[12]。

果膠=C×V×K×100/（W×106）×100%

式中，C為果膠含量（μg/mL）；V為果膠提取液原液體積（mL）；K為果膠提取液稀釋倍數(shù)；W為樣品質量（g）。

咔唑比色法標準曲線的繪制：準確稱取0.100 0 g半乳糖醛酸標準品于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后轉移至100 mL容量瓶中，用pH 3的鹽酸定容。分別取0、1、2、3、4、5、6、7 mL于8個100容量瓶中，用pH 3的鹽酸定容，得到濃度為0、10、20、30、40、50、60、70 μg/mL的標準溶液。根據(jù)咔唑比色法測定，然后繪制咔唑比色法的標準曲線。

果膠降解率：Ei=（C0-Ci）/C0 ×100%

式中，Ei為果膠的降解率；C0為空白對照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；Ci為加酶處理的混合漿中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量。

1.4.2 熱裂解產(chǎn)物的測定 采用裂解器和GC-MS聯(lián)機在線方式對樣品的裂解產(chǎn)物進行測定。稱取一定量的樣品置于裂解裝置中，裂解條件：初始溫度 30 ℃，升溫速率20.00 ℃/ms，裂解溫度 600 ℃，持續(xù)時間 10 s，載氣為氦氣。

熱裂解產(chǎn)物用HP6890GC/5973質譜儀檢測。GC/MS分析條件：色譜柱 DB-5MS彈性石英毛細管色譜柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度 280 ℃；進樣量 1 μL；分流比 50∶1；載氣為氦氣；升溫程序 50 ℃（2 min），280 ℃（10 min）；傳輸線溫度 280 ℃；EI源電子能量 70 eV；電子倍增器電壓 1 600 V；質量掃描范圍 30～550 amu；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度 150 ℃；利用NIST11標準譜庫檢索對采集到的質譜圖進行結構鑒定。

1.5 感官評價

以最優(yōu)酶解條件處理的混合漿制成片基，再烘干（80 ℃）至濕度為65%后切絲，取配方煙絲若干，放置于恒溫恒濕箱內平衡，相對濕度（60±5）%，溫度（22±2） ℃ 48 h。按煙絲重量15%（即稱取0.12 g樣品）添加片基絲與85%配方煙絲均勻混合后手動卷煙，試驗組為酶解處理后的樣品，對照組為滅活酶液處理后的樣品，空白組為去離子水。按照國標要求每支煙只總重（0.80±0.01） g的標準卷制樣品[13]，在溫度（22±2） ℃、相對濕度（60±5）%的恒溫恒濕箱中平衡24 h后對卷煙進行質量評吸鑒定和評價。

2 結果與分析

2.1 咔唑的標準曲線

以半乳糖醛酸的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為y=0.008 8x+0.009 8，相關系數(shù) 0.999 1，相關性良好。

2.2 混合漿中果膠酶解工藝的優(yōu)化

2.2.1 酶活力對果膠降解效果的影響 由圖1a可以看出，樣品果膠的降解率隨酶活力的增大呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢，但是當酶活為29 000 U/mL時稍有下降。當酶活力為10 000 U/mL時，樣品果膠的降解率達到最大。因此，選擇酶活力為3 700、10 000、29 000 U/mL的粗酶液作為正交試驗設計中酶活力的3個水平。

2.2.2 反應時間對果膠降解效果的影響 由圖1b可以看出，果膠的降解率隨反應時間的增加呈現(xiàn)先增大后平緩的變化趨勢。當反應時間增加到2.5 h時，果膠降解率達到最大。因此，選擇反應時間2.0、2.5、3.0 h作為正交試驗反應時間的水平。

2.2.3 料液比對果膠降解效果的影響 由圖1c可以看出，當料液比在1∶7以內時，混合漿與酶混合充分，降解率隨著料液比的變化呈現(xiàn)波浪狀變化趨勢，降解率較高，且變化不大。當料液比為1∶9時，混合漿與酶液被稀釋，降解效果變差。因此，選擇料液比1∶1、1∶3、1∶5進行后續(xù)試驗。

2.2.4 反應溫度對果膠降解效果的影響 由圖1d可以看出，樣品中果膠的降解率隨反應溫度的增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢；當反應溫度達到50 ℃時，果膠的降解率達到最大。說明當溫度在50 ℃時，酶的活性最大；當反應溫度為55 ℃時，降解率迅速下降，可能是由于酶活性被鈍化引起。因此，選擇溫度45、50、55 ℃作為正交試驗反應溫度的水平。

2.3 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，選取酶活力、料液比、反應時間和反應溫度這4個主要影響果膠降解率的因素進行正交試驗，其中每個因素選取3個水平，以降解率為考察指標進行試驗，正交試驗結果見表2。由極差分析可知，各個因素對降解率的影響由大到小依次為反應時間、料液比、酶活力、反應溫度。4 種因素對果膠降解率的最優(yōu)組合是 A2B1C2D3，即酶活力為10 000 U/mL、料液比1∶1、反應溫度50 ℃、處理時間3.0 h。在最優(yōu)組合條件下進行驗證，樣品果膠降解率達到最大，為（29.26±1.06）%。

2.4 再造煙葉酶處理前后熱裂解產(chǎn)物分析

高濃度混合漿經(jīng)酶處理前后，其裂解成分分類如表3所示。其中裂解產(chǎn)物成分的組成、相對含量均發(fā)生了明顯的變化。根據(jù)官能團不同，將檢測出的化合物分為7類。由表3可以看出，酶處理前后除醛酮類和雜環(huán)類化合物的相對含量分別增加2.03和1.96個百分點以外，其他化合物均有所降低。其中酸類、酯類、萜烯類、苯環(huán)及酚類、醇類化合物的含量分別降低了0.50、1.17、0.80、1.32和0.04個百分點。

從表3還可以看出，與對照組相比，酶處理后的混合漿中醛酮、雜環(huán)類和醇類物質的種類有所增加?？赡苁怯捎诠z在果膠酶的作用下，被分解成小分子的還原糖類，如葡萄糖和果糖等。同時混合漿中的纖維素在高活化能條件下生成各種高分子量的芳香族產(chǎn)物[14]。在低溫條件下，沸點較低的小分子物質，如果糖和葡萄糖首先氣化，被裂解成內酯、酮、短鏈羧酸和環(huán)戊烷衍生物等化合物，其成分與美拉德反應的香味成分相當；當裂解溫度繼續(xù)升高時，雜環(huán)類化合物會發(fā)生裂解、聚合或者縮合反應，產(chǎn)生呋喃、酮類和醛類等多種香氣物質；而當溫度繼續(xù)升高時，碳氫化合物會進一步形成比較穩(wěn)定的芳烴、糠醛、酚類和稠環(huán)類芳烴等香氣物質，同時也會產(chǎn)生乙醛和丙酮等刺激性物質[15，16]。

2.5 感官效果評吸結果

感官評價結果（表4）表明，酶解后的樣品添加于卷煙中，使卷煙的香氣質更加細膩，煙氣透發(fā)性更好，增加甜潤感且刺激性減輕，口感發(fā)澀程度減小，使得余味純凈舒適，勁頭足，燃燒性更好，吸食品質得以提升。

3 小結與討論

1）通過單因素和正交試驗獲得果膠酶降解的高濃度混合漿中果膠的最佳反應條件為酶活力為10 000 U/mL、料液比1∶1、反應溫度50 ℃、處理時間3.0 h，果膠降解率達到最大，為（29.26±1.06）%。

2）經(jīng)過熱裂解GC-MS分析，高濃度混合漿經(jīng)酶處理前后，其裂解產(chǎn)物成分的組成、相對含量均發(fā)生了明顯變化。酶處理前后除醛酮類和雜環(huán)類化合物的相對含量分別增加2.03和1.96個百分點以外，其他化合物均有所降低。其中酸類、酯類、萜烯類、苯環(huán)及酚類、醇類化合物的含量分別降低了0.50、1.17、0.80、1.32、0.04個百分點。與對照組相比，酶處理后的混合漿中醛酮、雜環(huán)類和醇類物質的種類有所增加，其他物質的種類減少。

3）對比裂解前后的產(chǎn)物的種類、數(shù)量與相對含量，結合生物質（果膠、纖維素等）的裂解原理，可以得出，本試驗中利用黑曲霉產(chǎn)果膠酶降解高濃度混合漿中的果膠作用明顯。

4）評吸結果表明，果膠酶處理高濃度混合漿制成的煙草薄片能夠減少刺激性，使卷煙的香氣質更加細膩，燃燒性增強，提高了吸食品質。

5）本試驗在用黑曲霉SW06產(chǎn)出的果膠酶降解混合漿中的果膠方面采用咔唑比色法等客觀的評價方法，使得高效產(chǎn)果膠酶的真菌篩選研究更加科學、高效，但對于熱裂解后的產(chǎn)物生成機理還需進一步研究，為生物降解在再造煙葉的混合漿生產(chǎn)中的應用提供理論基礎。

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