摘要：試驗(yàn)優(yōu)選了過山楓（Celastrus aculeatus Merr.）總芪類的提取和純化工藝條件。以過山楓總芪類提取率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選提取總芪類的工藝條件；以大孔樹脂的比飽和吸附量與總芪類的回收率為指標(biāo)，通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)試驗(yàn)優(yōu)選樹脂純化總芪類的工藝條件。結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為5倍量95%乙醇加熱回流提取1次，每次1 h，總芪類提取率為0.74%。最佳樹脂純化工藝條件為選擇DM130樹脂，采用20 mm直徑的層析柱，上樣溶液的總芪類濃度為5.86 mg/mL，10 g樹脂上樣30 mL，流速控制在3 mL/min，待吸附后先以30%乙醇洗脫200 mL除雜，再用200 mL 50%乙醇解吸。純化后總芪類的含量達(dá)到58.52%，回收率為60.92%。此優(yōu)選的工藝合理可行，能夠較好地從過山楓中提取和純化總芪類。

關(guān)鍵詞：過山楓（Celastrus aculeatus Merr.）；總芪類；正交試驗(yàn)；提??；純化

中圖分類號：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0706-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.040

Abstact： To optimize the extraction and purification processes of total stilbenoids from Celastrus aculeatus Merr. Orthogonal test was adopted to optimize extraction process by recording the extraction ratio of total stilbenoids as response indexes. Static and dynamic tests were employed to optimize purification process by taking the adsorption capacity of macroporous resin and the recovery of total stilbenoids as index. The optimum extraction process as follow： the total stilbenoids were extracted 1 times with 5-fold 95% ethanol for 1 hours at reflux. The extraction ratio of total stilbenoids was 0.74% under these conditions. The optimum adsorption conditions as follows： DM130 macroporous resin as chromatographic material， 20 mm as the diameter of chromatographic column， 30 mL as adsorption volume of sample solution per 10 g resin， 5.86 mg/mL as total stilbenoids concentration in the sample solution， 3 mL/min as flow rate. After adsorption， 200 mL ethanol（30%） were used to wash out the substance， then 200 mL ethanol（50%） were used for desorption. The concentration of total stilbenoids was 58.52% after purification， and the recovery of total stilbenoids was 60.92%. The optimum processes were reasonable and feasible. Through these processes， total stilbenoids can be extracted and purified from Celastrus aculeatus Merr. easily.

Key words： Celastrus aculeatus Merr.；total stilbenoids；orthogonal test；extraction；purification

過山楓（Celastrus aculeatus Merr.）是衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物，藥用其根及藤莖，有清熱解毒、祛風(fēng)除濕的功效，民間常用其煎湯或外敷治療風(fēng)濕痹痛[1]。該藥材產(chǎn)于浙江、福建、廣東、廣西等地，目前已有人工引種栽培。研究發(fā)現(xiàn)過山楓主要含有萜類、黃酮、芪類等成分[2]。大量藥理學(xué)試驗(yàn)表明，以白藜蘆醇為代表的芪類化合物具有抗炎免疫[3]、抗氧化、抗癌[4，5]、抗病毒[6]等多種功效，在醫(yī)藥領(lǐng)域有著巨大的需求。因此藥用作物過山楓的總芪類成分的開發(fā)前景良好，但目前國內(nèi)鮮見針對總芪類的提取和純化工藝[7-9]。本試驗(yàn)為了從過山楓中制備總芪類含量大于50%的提取物，以過山楓總芪類提取率為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選提取總芪類的工藝條件；以大孔樹脂的比飽和吸附量與總芪類的回收率為指標(biāo)，通過靜態(tài)和動(dòng)態(tài)試驗(yàn)優(yōu)選樹脂純化總芪類的工藝條件，為傳統(tǒng)中藥過山楓的資源利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、藥品和儀器

過山楓材料采自廣東南部，經(jīng)華南植物園葉華谷教授鑒定為衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物過山楓的根莖，樣品存放于華南植物園標(biāo)本室。反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品（上海安耐吉化學(xué)有限公司）；95%乙醇，其余試劑為分析純。UV3100型紫外-可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；THZ-C型恒溫振蕩器（江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；DBS-100N型電腦全自動(dòng)部分收集器（上海青浦滬西儀器廠）；PB-2型恒流泵（上海金達(dá)生化儀器有限公司）；6種型號大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）。

1.2 測定方法

1.2.1 總芪類的測定方法

1）對照品溶液的配置：稱取反式白藜蘆醇標(biāo)準(zhǔn)品0.011 g，用乙醇溶解定容于100 mL容量瓶中。分別精確吸取對照品溶液0.30、0.60、0.90、1.20、1.50 mL置于10 mL容量瓶中，以95%乙醇定容，即得濃度分別為3.30、6.60、9.90、13.20、16.50 μg/mL的對照品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將反式白藜蘆醇對照品溶液在200～800 nm波段下掃描。在242 nm和318 nm兩處有最大吸收峰，但242 nm處會(huì)有較多的雜質(zhì)吸收，而在318 nm的吸收是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)上兩個(gè)苯環(huán)通過雙鍵連接起來的長共軛體系的產(chǎn)生，雜質(zhì)的干擾小，所以本試驗(yàn)選定318 nm作為測定波長。以95%乙醇做參比，測定318 nm波長下5份標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。

1.2.2 提取工藝正交試驗(yàn) 參考相關(guān)工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)[10，11]，加熱回流提取工藝中，影響提取率的主要因素包括：乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)。為避免過高的提取溫度造成總芪類成分被破壞，固定提取溫度為50 ℃，只選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，在單因素預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)表1所示因素和水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，每組按方法提取50 g藥材，以總芪類的提取率為指標(biāo)優(yōu)選提取工藝。

1.2.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 稱取過山楓細(xì)粉約1 kg，以乙醇、料液比1∶5（g∶mL，下同）、提取1次、每次提取1 h，提取液抽濾、干燥、稱重，并測定總芪類的含量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 萃取純化 將“1.2.3”方法下所得的浸膏，用水分散，先后經(jīng)石油醚、乙酸乙酯各萃取3次，取乙酸乙酯萃取層濃縮、干燥得到萃取物干膏。取29.07 g干膏加水溶解，定容至1 L，即得樣品溶液備用。

1.2.5 樹脂純化工藝的優(yōu)選

1）樹脂種類的選擇：利用靜態(tài)吸附、解吸試驗(yàn)，以大孔樹脂的靜態(tài)比飽和吸附量Q1和理想狀態(tài)下總芪類的回收率D1為評價(jià)指標(biāo)，從6種常見樹脂中篩選出適合純化過山楓總芪類的樹脂。將預(yù)處理的樹脂置于錐形瓶中（每瓶約2 g），加“1.2.4”方法下制備的樣品溶液40 mL，封口置于恒溫振蕩器中吸附10 h（轉(zhuǎn)速120 r/min）。抽濾，去離子水清洗樹脂，合并濾液和洗清洗液，測定Q1值。再將樹脂放回錐形瓶，加95%乙醇40 mL，解吸10 h（轉(zhuǎn)速120 r/min），測定D1值。

2）上樣條件的確定：樣品溶液的上樣過程主要涉及層析柱柱徑、流速、上樣濃度、上樣量、樹脂用量這5個(gè)變動(dòng)因素[12，13]，動(dòng)態(tài)吸附試驗(yàn)需要綜合所有因素考慮，選出最佳方案。從高效利用樹脂的角度出發(fā)，優(yōu)選出樹脂最大吸附效率的方法。因此選擇上樣濃度、流速、柱徑作為考察因素，在單因素預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)之上設(shè)計(jì)表2中因素和水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。每組稱取約10 g的優(yōu)選出的樹脂裝柱，加入過量體積的樣品溶液。記錄當(dāng)發(fā)生總芪類泄漏時(shí)（即溶液的吸光度A>0.10）的最大上樣體積，并計(jì)算出動(dòng)態(tài)比飽和吸附量（即每克樹脂的最大上樣量）Q2。以Q2作為評價(jià)指標(biāo)來優(yōu)選最佳上樣方法。

3）上樣量的確定：取10 g優(yōu)選出的樹脂，按以上動(dòng)態(tài)吸附正交試驗(yàn)優(yōu)化條件，重復(fù)3次試驗(yàn)，測定最大上樣體積。

4）洗脫條件的確定：按動(dòng)態(tài)吸附正交試驗(yàn)優(yōu)化條件，10 g樹脂上樣30 mL樣品溶液。采用10%～90%乙醇梯度洗脫的方式，每10%為1個(gè)梯度，每梯度洗脫200 mL（約10倍柱體積），流速為3 mL/min，測定每梯度洗脫液的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制總芪類在優(yōu)選樹脂柱中的梯度洗脫曲線。同時(shí)測定實(shí)際洗脫過程中總芪類的回收率D2。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以白藜蘆醇濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為Y=0.098 01X+0.155（R2=0.999 1），線性范圍3.30～16.50 μg/mL。

2.2 提取工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3分析可知，4個(gè)因素的影響強(qiáng)度順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)（A）、提取次數(shù)（C）、料液比（B）、提取時(shí)間（D），推測最佳工藝為A3B2C3D3。以k值最小的影響因素D作為誤差項(xiàng)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，只有乙醇體積分?jǐn)?shù)對總芪類提取率有顯著影響。結(jié)合實(shí)際情況，從節(jié)省時(shí)間的角度出發(fā)，只將乙醇體積分?jǐn)?shù)設(shè)定為最大值95%。所以確立最佳提取工藝為95%乙醇，按1∶5的料液比提取1次，每次1 h。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，所得浸膏平均質(zhì)量為84.99 g，其中總芪類的平均含量為8.82%，平均提取率為0.75%。結(jié)果與預(yù)期相符，表明最佳提取工藝穩(wěn)定、可靠。

2.4 萃取純化結(jié)果

將驗(yàn)證試驗(yàn)所得浸膏進(jìn)行萃取純化，經(jīng)檢測，純化后所得總芪類的濃度為5.86 mg/mL，含量為20.17%。

2.5 樹脂純化工藝的優(yōu)選

6種樹脂靜態(tài)下的吸附與解吸性能結(jié)果見表5。從表5可知，DM130樹脂的Q1與HPD400的相近，但D1更高，能回收更多的總芪類。綜合考慮，本試驗(yàn)選擇DM130樹脂進(jìn)行純化。

2.6 動(dòng)態(tài)吸附正交試驗(yàn)

由表6直觀分析可知，上樣濃度、流速、柱徑3個(gè)因素對DM130樹脂動(dòng)態(tài)吸附過程Q2的影響能力強(qiáng)弱順序?yàn)橹鶑剑–）、上樣濃度（A）、流速（B）。方差分析的結(jié)果見表7。由表7可知，3個(gè)因素對樹脂動(dòng)態(tài)吸附過程Q2都沒有顯著影響。限于試驗(yàn)室的實(shí)際情況，選擇最佳上樣條件為A3B3C3，以達(dá)到樹脂的最大吸附效率。在實(shí)際擴(kuò)大生產(chǎn)中可以增大柱徑，來增加樹脂的吸附效率。

2.7 上樣量的確定

按照動(dòng)態(tài)吸附正交試驗(yàn)優(yōu)化條件A3B3C3，重復(fù)3次試驗(yàn)，測定得到最大上樣體積分別為30、35、35 mL，Q2的平均值為19.53 mg/g，結(jié)果符合正交試驗(yàn)的預(yù)測。為防止總芪類的泄漏，試驗(yàn)最終選擇上樣體積為30 mL，Q2為 17.58 mg/g，即每10 g樹脂上樣30 mL樣品溶液。

2.8 洗脫條件的確定

以吸光度為縱坐標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制總芪類在優(yōu)選樹脂柱中的梯度洗脫曲線，結(jié)果如圖1所示。從洗脫曲線可知，多數(shù)芪類成分集中于40%和50%乙醇的洗脫液中。雖然在80%的洗脫液中也含有少量的芪類成分，但含有大量其他成分。在保證總芪類含量大于50%的條件下，只合并40%和50%乙醇的洗脫液作為目標(biāo)餾分。合并目標(biāo)餾分，測定總芪類的回收率D2為60.92%，純化后總芪類的含量為58.52%。

綜上所述，最佳的樹脂純化工藝條件為選擇DM130樹脂，采用20 mm直徑的層析柱，以總芪類濃度為5.86 mg/mL的溶液上樣，10 g樹脂上樣30 mL，流速控制在3 mL/min，待吸附完全后先以30%乙醇洗脫200 mL除雜，再用200 mL 50%乙醇解吸，即得到總芪類含量大于50%的過山楓提取物。

3 小結(jié)與討論

從主要有效部位含量大于50%的中藥五類藥的要求出發(fā)，建立了從過山楓中提取、萃取純化、樹脂純化總芪類的完整工藝流程，用以制備總芪類含量大于50%的過山楓提取物，為藥用植物過山楓的應(yīng)用開發(fā)提供了工藝制備基礎(chǔ)。其中純化步驟所選用的大孔樹脂柱色譜法，已被廣泛應(yīng)用于各種傳統(tǒng)中藥的純化工藝當(dāng)中[14]。但在試驗(yàn)制備的過程中僅采用樹脂純化，所得終產(chǎn)物中的總芪類含量難以達(dá)到50%。因此，本研究根據(jù)天然單體芪類化合物都易溶于醇、酯的特性，設(shè)計(jì)在樹脂純化前增加萃取純化的環(huán)節(jié)，在提高總芪類含量的同時(shí)，減少樹脂純化步驟的工作量。理論推算，1 kg的過山楓原料，經(jīng)最佳的提取工藝，提取物的質(zhì)量為84.99 g，總芪類成分的平均含量為8.82%；經(jīng)萃取工藝后，產(chǎn)物的質(zhì)量為19.36 g，總芪類成分的含量提升至20.17%；經(jīng)樹脂純化工藝后，總芪類成分的含量為58.52%。該工藝流程特點(diǎn)是穩(wěn)定性好、操作簡單、節(jié)約成本，該工藝方法有著良好的應(yīng)用前景。

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