摘要：研究了4種柱花草種子萌發(fā)過程中參與氮代謝的蛋白酶、肽酶和硝酸還原酶活性的動態(tài)變化。結(jié)果表明，蛋白酶的活性隨著柱花草種子萌發(fā)的深入而不斷上升，在種子即將露白胚根突破種皮的時候蛋白酶活性達到最大值。此后，隨著胚芽的生長蛋白酶活性逐漸降低，其中熱研2號柱花草的蛋白酶活性高于其他3種；肽酶活性的變化總體呈上升趨勢；硝酸還原酶呈S型變化。了解柱花草種子萌發(fā)期各種酶活性的變化規(guī)律，為深入研究柱花草種子萌發(fā)時貯藏物質(zhì)的動員和代謝機理提供數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞：柱花草[Stylosanthes guianensis （Aubl） SW.]；種子萌發(fā)；氮代謝；酶活性

中圖分類號：S54 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）03-0695-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.037

Abstract： This paper studied the dynamic change of protease， peptidase and nitrate reductase activity involved in nitrogen metabolism of four kinds of Stylos seed germination process， the results showed protease activity increased with Stylo seed germination， reached a maximum when the radicle breakthrough seed coat.Thereafter， protease activity decreased gradually with the growth of germs， protease activity of Stylo cv. Reyan NO.2 was higher than the others.The overall change in peptide activity showed increasing trend. Nitrate reductase was S shape change. Understood the variation rule of the various enzyme activity during seed germination of Stylo， to provide data for further study on the mechanism of mobilization and metabolism during Stylo seeds germination of storage substances.

Key words：Stylo；seed germination；nitrogen metabolism；enzyme activity

種子萌發(fā)是蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過程，萌發(fā)時貯藏物質(zhì)要從貯藏部位運輸?shù)嚼貌课唬仨毷紫冉?jīng)過分解，而在整個代謝過程中酶起到了關(guān)鍵的作用[1-3]。種子萌發(fā)時有多種酶參與，蛋白質(zhì)降解通常按其底物特性分為蛋白酶和肽酶。種子萌發(fā)時貯藏蛋白質(zhì)在肽酶等作用下進行有限水解，接下來由蛋白酶從蛋白質(zhì)亞基的近中端切分出小分子片段，肽酶又作用于小分子，使其降解成氨基酸，完成貯藏物質(zhì)的最終降解，為種子萌發(fā)和幼苗早期生長提供營養(yǎng)物質(zhì)和能源[4-6]。硝酸還原酶是植物氮代謝中的關(guān)鍵酶之一，它與植物吸收利用氮素有關(guān)，對植物的產(chǎn)量和品質(zhì)有影響[7]。關(guān)于種子萌發(fā)過程中各種酶的活性變化研究多集中于糧食、經(jīng)濟作物，對于柱花草來的相關(guān)研究很少[8-12]。

柱花草[Stylosanthes guianensis （Aubl） SW.]是中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所在20世紀(jì)80年代從國外引進的種質(zhì)，已從中選育出了一批優(yōu)良的豆科牧草新品種[13-15]。柱花草性喜濕熱，適生于我國熱帶、南亞熱帶地區(qū)，目前在海南、廣東、廣西等省區(qū)的推廣面積約50多萬公頃。它是一種多功能、多效益的作物，能同農(nóng)、林、畜牧業(yè)緊密結(jié)合，互相促進，產(chǎn)生良好的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益[16-18]。對柱花草的營養(yǎng)代謝研究是一個全新的領(lǐng)域，它對了解種子內(nèi)部生理功能，揭示柱花草種子萌發(fā)的代謝機理，有很高的研究價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗所用柱花草種子采集自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州院區(qū)牧草基地，為以下4種柱花草品種：熱研2號柱花草（S. guianensis SW. cv. Reyan No.2）、維拉諾有鉤柱花草（S. hamata （L.）Taub.cv. Verano）、西卡柱花草（S. scabra Vog cv.Seca）和馬弓形柱花草（S. hippocampoides Fine stem stylo）。

1.2 方法

選取飽滿、大小一致的種子進行發(fā)芽試驗。種子用80 ℃熱水浸泡3～5 min后取出冷卻，將處理后的種子放置于鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，于恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃、光照12 h、1 600 lx）中發(fā)芽，每隔2 d噴水一次保持濾紙的濕潤。

1.3 樣品制備

選取4種柱花草種子6種萌發(fā)狀態(tài)下的胚乳為樣品，并記錄每種萌發(fā)狀態(tài)下的種子長度、幼芽長（表1），裝入相對應(yīng)的密封塑料袋中，貼好標(biāo)簽，放入-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 儀器設(shè)備

高速帶溫控離心機（TGL20M上海趙迪）、恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9272上海一恒）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S6江蘇諾基）、離心機（L-550湖南湘儀）、可見光分光光度計（N4上海儀電）、-80 ℃立式超低溫冰箱（DW-HL669中科美菱）。

1.5 測定項目

蛋白酶活性采用甲醛滴定法測定，肽酶活性采用比色法測定（亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線），硝酸還原酶活性采用比色法測定[19，20]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel進行制圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶活性的變化

由圖1中可知，蛋白酶的活性隨著種子萌發(fā)的深入而不斷上升，在種子即將露白胚根突破種皮的時候蛋白酶活性達到最大值。此后，隨著胚芽的生長蛋白酶活性逐漸降低。其中熱研2號柱花草在不同萌發(fā)狀態(tài)的蛋白酶活性高于其他3種，在種子胚根突破種皮時的蛋白酶活性較未處理種子的蛋白酶活性增加了114%，到萌發(fā)后期較未處理種子降低了52%。維拉諾有鉤柱花草在種子胚根突破種皮時的蛋白酶活性較未處理種子的蛋白酶活性增加了120%，到萌發(fā)后期活性明顯降低。西卡柱花草在種子胚根突破種皮時的蛋白酶活性較未處理種子的蛋白酶活性增加了125%，到萌發(fā)后期較未處理種子降低了67%。馬弓形柱花草在種子胚根突破種皮時的蛋白酶活性較未處理種子的蛋白酶活性增加了125%，到萌發(fā)后期活性降低。4個草種在種子胚根突破種皮時的蛋白酶活性增加幅度差異小，到萌發(fā)后期活性降低幅度差異明顯，馬弓形柱花草>西卡柱花草>維拉諾有鉤柱花草>熱研2號柱花草。

2.2 肽酶活性的變化

由圖2可知，4種柱花草在種子萌發(fā)過程中的肽酶活性的變化總體上都呈上升趨勢。在萌發(fā)早期種子未露白前，肽酶活性略有增加。當(dāng)胚根突破種皮而出，肽酶活性陡然增加，后隨種子子葉的展開，肽酶活性增加緩慢，一直到萌發(fā)后期酶活性都在增加。其中熱研2號柱花草萌發(fā)后期酶活性較萌發(fā)初期增加了171%，較萌發(fā)中期增加了36%。維拉諾有鉤柱花草萌發(fā)后期酶活性較萌發(fā)初期增加了200%，較萌發(fā)中期增加了50%。西卡柱花草萌發(fā)后期酶活性較萌發(fā)初期增加了371%，較萌發(fā)中期增加了175%。馬弓形柱花草萌發(fā)后期酶活性較萌發(fā)初期增加了375%，較萌發(fā)中期增加了175%。4個草種在萌發(fā)后期酶活性增加幅度差異明顯，馬弓形柱花草=西卡柱花草>維拉諾有鉤柱花草>熱研2號柱花草。

2.3 硝酸還原酶活性的變化

由圖3可知，硝酸還原酶在未處理的柱花草種子中就具有活性，通過催芽處理種子開始萌發(fā)時酶活性逐漸上升，到露白胚根突破種皮時，酶活性迅速增加達到最大值，萌發(fā)后期胚芽開始生長酶活性逐漸下降，整個萌發(fā)過程中，硝酸還原酶呈S形變化。其中在種子即將露白胚根突破種皮時4個柱花草酶活性活性較未處理種子的硝酸還原酶活性增加幅度差異較小，在50%～60%之間；到萌發(fā)后期硝酸還原酶酶活性較未處理種子的酶活性降低幅度差異明顯，西卡柱花草>熱研2號柱花草>維拉諾有鉤柱花草>馬弓型柱花草。

2.4 蛋白酶、肽酶以及硝酸還原酶活性變化的比較分析

進一步對熱研2號柱花草種子萌發(fā)過程中蛋白酶、肽酶和硝酸還原酶活性的動態(tài)變化進行回歸分析，發(fā)現(xiàn)蛋白酶活性的變化與硝酸還原酶活性的變化之間存在極顯著性線性相關(guān)（表2）。說明硝酸還原酶參與氮代謝的作用機理與蛋白酶的作用機理相關(guān)，它同樣與柱花草種子萌發(fā)關(guān)系密切，能夠衡量種子萌發(fā)過程中的氮代謝狀況。同樣從表2中得出，在熱研2號柱花草種子萌發(fā)中參與氮代謝的蛋白酶活性與肽酶活性、肽酶活性與硝酸還原酶活性之間沒有顯著的相關(guān)關(guān)系。

3 小結(jié)與討論

1）柱花草種子萌發(fā)過程中，蛋白酶隨著種子的萌發(fā)，酶活性逐漸增加，當(dāng)種子露白胚根突破種皮時酶活性達到最大，隨后活性逐漸下降；肽酶活性總體變化呈上升趨勢，萌發(fā)初期酶活性變化不大，隨著萌發(fā)的進行酶活性增加；硝酸還原酶活性呈S型變化，隨著萌發(fā)的進行酶活性增加，幼芽開始生長后酶活性逐漸下降。

2）柱花草種子開始萌發(fā)后，蛋白酶活性增加，分解足夠多的蛋白質(zhì)分解來滿足生長所需。在種子胚根突破種皮的時候，胚芽所需的營養(yǎng)物質(zhì)達到最大，所以此時蛋白酶的活性最高。胚根露白后，胚根可以從外環(huán)境中獲取營養(yǎng)物質(zhì)，從胚乳獲取營養(yǎng)物質(zhì)的需求減緩，因而蛋白酶活性降低。到了萌發(fā)后期，胚乳中的蛋白質(zhì)大部分被降解掉，蛋白酶失去了作用底物，所以活性急劇降低達到最低值。

3）在柱花草種子萌發(fā)過程中，肽酶活性隨著蛋白質(zhì)的降解而逐漸增加。種子萌發(fā)初期，肽酶作用的底物如多肽和二肽等物質(zhì)還很少，所以肽酶活性低且變化不大。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)開始降解，肽酶的作用底物增加，因而其活性增加。在種子萌發(fā)后期肽酶活性繼續(xù)增加，說明此時肽酶降解肽類物質(zhì)，分解成小分子氨基酸，提供幼芽生長發(fā)育。

4）硝酸還原酶是硝酸鹽同化成氨基酸、繼而轉(zhuǎn)化成細胞的各種含氮化合物的一系列反應(yīng)中的第一酶。在柱花草種子萌發(fā)過程中，酶活性呈先上升后下降的趨勢，這一變化規(guī)律同蛋白酶活性的變化相似。硝酸還原酶活性與種子萌發(fā)關(guān)系密切，可以作為衡量種子萌發(fā)程度的生化指標(biāo)，能夠衡量種子萌發(fā)的氮代謝狀況。

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