摘要：為研究肝細(xì)胞脂肪變性后發(fā)生的變化。采用體外培養(yǎng)DL-乙硫氨酸誘導(dǎo)的大鼠原代肝細(xì)胞作為試驗(yàn)材料。油紅O染色經(jīng)5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸處理的貼壁良好培養(yǎng)24 h和48 h的肝細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡400倍下觀察肝細(xì)胞的脂質(zhì)變化，拍照，分析生化指標(biāo)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見正常脂滴，大量大小不一顏色鮮紅的脂滴染色后匯集成塊于模型組細(xì)胞胞漿內(nèi)。模型組載脂蛋白B含量降低，甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白含量升高，與對(duì)照組比較差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞培養(yǎng)；脂肪肝；油紅O染色；DL-乙硫氨酸

中圖分類號(hào)：S852.35 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）03-0689-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.03.035

Abstract： To investigate the change of hepatocytes adipose degeneration. The rat primary cultured hepatocytes induced by DL-ethionine were used.The normal aladhered hepatocytes were treated with 5.0 mmol/L DL-ethionine for 24 h and 48 h，stained with oil red O and observed under microscope 400×， meanwhile some biological indices were measured and analysised.The results as follows：there were a few normal lipid droplets in the hepatocytes of control group， but many of them in the hepatocytes of model group， bright red color，and some lipid droplets were flaky. The contents of triglyceride， low density lipoprotein and high density lipoprotein go to heighten in model group，apolipoprotein B to lower，and between the control model group and model group were significant（P<0.01）. The further observation of hepatocytes adipose degeneration was carried out， and it provide correct in vitro investigation of fatty liver patient.

Key words：hepatocyte culture；fatty liver；oil red O staining；DL-ethionine

脂肪肝的基礎(chǔ)是肝臟脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化，體內(nèi)及肝內(nèi)脂質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡被打破，引發(fā)肝細(xì)胞合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解紊亂。目前脂肪肝試驗(yàn)研究中常用的動(dòng)物病理模型是藥物誘導(dǎo)脂肪肝模型，誘因是載脂蛋白復(fù)合物的合成受藥物影響，當(dāng)含量下降時(shí)，極低密度脂蛋白（VLDL）含量增加，肝臟脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)不出去，肝臟脂肪病變由此產(chǎn)生[1-4]。保肝藥物的臨床試驗(yàn)大多從動(dòng)物活體上獲取，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，本研究從分離、體外培養(yǎng)和藥物誘導(dǎo)后脂肪變性的肝細(xì)胞的形態(tài)、生理指標(biāo)的變化來分析肝細(xì)胞發(fā)生的變化，為保肝藥物的研究提供試驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗(yàn)動(dòng)物用1～2月齡健康清潔級(jí)SD雄性大鼠由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。參照文獻(xiàn)[5-7]配制二步灌流法需要的洗液；試驗(yàn)儀器和試驗(yàn)材料由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)與檢測(cè)

分離培養(yǎng)原代肝細(xì)胞[8-10]，酸泡滅菌的蓋玻片鋪于培養(yǎng)板中，消毒槍頭抵住蓋玻片再鋪血清與肝細(xì)胞混合液，防止蓋玻片上浮產(chǎn)生縫隙，細(xì)胞不易于貼壁生長(zhǎng)。

倒置相差顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況，5.0 mmol/L DL-乙硫氨酸處理貼壁生長(zhǎng)良好的肝細(xì)胞為模型組，正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的為對(duì)照組，分別培養(yǎng)24 h和48 h。

10%中性甲醛浸泡被冷的PBS（pH 7.2）液沖掉雜質(zhì)的蓋玻片30 min，油紅O用于染色脂滴，蘇木精用于染色細(xì)胞核，明膠封片，拍照。

單因子方差分析對(duì)照組和模型組24 h和48 h細(xì)胞裂解液中的TG、ApoB、LDL和HDL的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 油紅O染色觀察

鏡檢可見，對(duì)照組脂滴正常分布于細(xì)胞內(nèi)（圖1-a）；模型組細(xì)胞內(nèi)分布有多個(gè)顏色濕潤(rùn)濃深的橘紅色脂滴，細(xì)胞核變小，說明肝細(xì)胞核損傷已形成，有的地方脂滴匯聚成團(tuán)，將細(xì)胞核壓向一邊，形態(tài)與對(duì)照組比較有顯著變化（圖1-b）。

2.2 DL-乙硫氨酸作用24 h和48 h后TG與ApoB含量

由表1可知，模型組細(xì)胞液中TG與ApoB含量與對(duì)照組相比，TG含量極顯著（P<0.01）升高，ApoB含量極顯著（P<0.01）下降。

2.3 DL-乙硫氨酸作用24 h和48 h后LDL與HDL含量

由表2可知，模型組細(xì)胞液中LDL、HDL含量與對(duì)照組相比，均極顯著（P<0.01）升高。

3 討論

肝細(xì)胞內(nèi)TG堆積的病理形態(tài)與濃度的變化證明肝細(xì)胞發(fā)生了脂肪變性。脂肪變性成功的大鼠肝細(xì)胞，與其他因素誘導(dǎo)成功的共同特征體現(xiàn)在：油紅O染色細(xì)胞內(nèi)脂滴匯聚成團(tuán)，從脂滴的顏色和數(shù)量可以看出TG含量增加，表明DL-乙硫氨酸誘導(dǎo)的結(jié)果已經(jīng)在肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝中體現(xiàn)。從生化指標(biāo)數(shù)據(jù)看出，DL-乙硫氨酸作用24 h時(shí)，TG從0.249 mmol/L升到1.285 mmol/L，說明細(xì)胞內(nèi)匯集有大量TG，與肝細(xì)胞脂肪化的病理形態(tài)相符合。

細(xì)胞內(nèi)能攝入ApoB介導(dǎo)的脂蛋白與細(xì)胞膜上的脂蛋白受體并被分解代謝，apoB含量下降，阻礙了TG從細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。從數(shù)據(jù)可以看出，DL-乙硫氨酸作用24 h時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)濃度變化比48h明顯，說明肝臟有一定的自我調(diào)節(jié)功能，但對(duì)于一些急性肝損傷還是需要藥物治療。肝細(xì)胞中apoB濃度的變化密切關(guān)系著HDL，LDL的含量。ApoB濃度下降，HDL和LDL濃度升高，在添加DL-乙硫氨酸后變化明顯。ApoB參與VLDL的合成、分泌，當(dāng)含量下降時(shí)，VLDL含量增加。載脂蛋白B的復(fù)合物合成過程被乙硫氨酸的乙基活動(dòng)末端所阻擾，合成降低。因此，VLDL轉(zhuǎn)運(yùn)不出去，TG含量升高。

總之，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性的方法可由DL-乙硫氨酸誘導(dǎo)其取得。從而對(duì)肝細(xì)胞脂肪變性有了更進(jìn)一步的研究，為脂肪肝患者實(shí)施正確的治療方案助一臂之力。

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