摘要：以銀杏（Ginkgo biloba L.）葉片外植體為試材，研究了不同激素組合培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體脫分化誘導(dǎo)愈傷組織的效果。結(jié)果表明，不同激素組合培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體啟動(dòng)脫分化（膨大）的效應(yīng)極顯著，且膨大率與膨大速度之間具有良好的一致性；不同培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)形成的效應(yīng)極顯著，且愈傷組織的誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)速度之間具有較好的協(xié)同性；綜合各項(xiàng)測量指標(biāo)，當(dāng)培養(yǎng)基中激素組合為MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT時(shí)，銀杏葉片誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)效果相對(duì)最佳。

關(guān)鍵詞：銀杏（Ginkgo biloba L.）；葉片；膨大；愈傷誘導(dǎo)；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)：R282 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0216-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.057

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科銀杏屬落葉喬木，又名白果、公孫樹、鴨腳樹、蒲扇，是新生代第四紀(jì)冰川期的孑遺植物，素有裸子植物“活化石”之稱，為中國獨(dú)存的珍稀名貴樹種[1]。銀杏葉中含有黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類化合物等多種生理活性物質(zhì)，具有擴(kuò)張血管、增加血流量、改善血液循環(huán)、降低腦血管阻力、抑制血栓形成、改善腦細(xì)胞代謝水平等作用[2-4]，已經(jīng)在食品、保健、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到廣泛開發(fā)利用。目前，利用銀杏愈傷組織的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)黃酮類次生代謝產(chǎn)物成為近年來發(fā)展的新領(lǐng)域[5-7]，但是由于銀杏初始愈傷組織的品質(zhì)與特性差異，往往造成生產(chǎn)量偏低，很難滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。目前，許多研究者從不同側(cè)面探索銀杏離體培養(yǎng)中培養(yǎng)基類型、激素、培養(yǎng)條件及其他相關(guān)因素對(duì)銀杏愈傷誘導(dǎo)的影響[8-11]。本研究以銀杏葉片為試材，以2，4-D、NAA、6-BA與KT 4種激素為效應(yīng)變量，分析不同激素組合培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體啟動(dòng)脫分化與愈傷誘導(dǎo)的效應(yīng)方式與效應(yīng)大小，為進(jìn)一步優(yōu)化銀杏愈傷組織培養(yǎng)條件，提高銀杏愈傷組織誘導(dǎo)效率，促進(jìn)其大規(guī)模細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)有效次生代謝產(chǎn)物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取陜西理工學(xué)院校園內(nèi)一株約10年生銀杏樹干萌發(fā)的幼嫩枝條上的新鮮葉片作為試驗(yàn)材料。試驗(yàn)用NAA（α-奈乙酸）、6-BA（6-芐基腺嘌呤）、2， 4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）與KT（呋喃氨基嘌呤）均為分析純；培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)材料預(yù)處理 選擇顏色鮮綠、完整健康、大小一致的銀杏葉片，用紗布擦掉表面灰塵，然后用自來水沖洗表面的雜質(zhì)1～2 h，在超凈工作臺(tái)采用乙醇-升汞配合消毒。將試材裝入消毒好的廣口瓶中，首先用75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1%升汞（HgCl2）浸泡10 min，處理過程中不斷搖動(dòng)，保證消毒液與葉片充分接觸，然后用無菌蒸餾水沖洗5～6次，每次2～3 min，放置于無菌濾紙上吸干水分。無菌操作條件下用解剖刀將銀杏葉片切分為長寬約0.5 cm的小塊，接種至不同組合的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 在MS培養(yǎng)基中加入不同劑量的NAA、6-BA、2，4-D與KT 4種激素，配制成試驗(yàn)所需的培養(yǎng)基（表1），各培養(yǎng)基中均按3.0%的濃度加入蔗糖，按0.6%的濃度加入瓊脂粉，調(diào)整pH為5.8～6.0，在121 ℃、1.3～1.5大氣壓下滅菌20 min，備用。

1.2.3 材料處理與誘導(dǎo) 無菌操作條件下，將預(yù)先準(zhǔn)備好的銀杏葉片外植體，分別接種至Ⅰ～Ⅸ培養(yǎng)基中，放置于溫度（25±2） ℃，相對(duì)濕度50%～60%，黑暗培養(yǎng)30 d，觀察愈傷組織的形態(tài)、顏色、質(zhì)地及生長情況，定期統(tǒng)計(jì)各處理中體積明顯膨大的外植體數(shù)與誘導(dǎo)出愈的外植體數(shù)，并依此計(jì)算出相應(yīng)的二級(jí)變量。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 接種10 d后，去除污染與壞死材料，統(tǒng)計(jì)無菌外植體數(shù)，視為接種外植體總數(shù)。依據(jù)定期統(tǒng)計(jì)的膨大數(shù)、出愈數(shù)計(jì)算出膨大率、膨大速度、誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)速度。計(jì)算公式如下：

膨大率=膨大外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

膨大速度=（WN-WM）/[（N-M）×Y]

誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)×100%

誘導(dǎo)速度=（ZN-ZM）/[（N-M）×K]

式中，WN代表第N天膨大的外植體數(shù)，WM代表第M天膨大的外植體數(shù)，K代表接種外植體總數(shù)，ZN代表第N天出愈的外植體數(shù)，ZM代表第M天出愈的外植體數(shù)。

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行one-way ANOVA分析，研究不同培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片愈傷組織誘導(dǎo)的效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)條件下銀杏葉片愈傷誘導(dǎo)的基本情況

將銀杏葉片外植體接種至試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9種培養(yǎng)基中，第三天左右各處理外植體顏色明顯加深，由原來的嫩綠色變?yōu)樯罹G色，第七天外植體明顯膨大，邊角增厚向內(nèi)卷曲，體積增加，在切口處及外植體表面產(chǎn)生少量淡黃色顆粒狀突起。第十天各處理培養(yǎng)基中外植體表面形成一薄層愈傷組織，最初為白色或淡黃色顆粒狀，質(zhì)地比較致密，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，愈傷細(xì)胞不斷分裂生長，外植體整個(gè)表面都被愈傷組織所覆蓋，愈傷顏色加深，多為黃綠色或綠色，質(zhì)地疏松或致密。不同激素組合處理對(duì)銀杏葉片愈傷組織誘導(dǎo)均有效果。激素組合配比方式不同，外植體的膨大頻率與愈傷誘導(dǎo)頻率存在明顯差異，愈傷組織的顏色、質(zhì)地及愈傷生長情況也不盡相同（表2）。

2.2 不同培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體膨大的效應(yīng)

以不同激素組合培養(yǎng)條件為自變量，分別以膨大率與膨大速度為因變量作單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見表3。單因素方差分析結(jié)果表明，不同激素組合條件對(duì)銀杏葉片外植體啟動(dòng)脫分化的效應(yīng)極顯著（F=48.465，P<0.01），即在不同激素組合配比條件下，銀杏葉片外植體的膨大率存在明顯差異。從各處理的培養(yǎng)效果對(duì)比分析（圖1），Ⅳ處理?xiàng)l件下銀杏葉片外植體膨大效果最為理想，可以達(dá)到外植體的完全脫分化，即膨大率為100.00%；Ⅷ處理次之，膨大率達(dá)96.00%，Ⅶ處理培養(yǎng)效果最差，膨大率僅為13.79%。不同激素組合培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片膨大速度這個(gè)因變量，也同樣表現(xiàn)出類似的顯著性效應(yīng)（F=7.342，P<0.01）。其中Ⅳ處理的膨大速度相對(duì)最快（0.043 9個(gè)/d），Ⅴ處理次之，Ⅰ處理與Ⅴ處理膨大速度基本相當(dāng)，Ⅶ處理膨大速度相對(duì)最慢，僅為0.005 3個(gè)/d。綜合直觀分析（圖1、圖2）與方差分析結(jié)果可以看出，銀杏葉片外植體啟動(dòng)脫分化（膨大）的靜態(tài)指標(biāo)（膨大率）與動(dòng)態(tài)指標(biāo)（膨大速度）之間表現(xiàn)出良好的一致性。Ⅳ處理膨大率和膨大速度均為最大值，而Ⅶ處理膨大率和膨大速度則處于相對(duì)較低的水平。

2.3 不同培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體出愈的效應(yīng)

誘導(dǎo)率作為衡量外植體出愈效果的一項(xiàng)重要指標(biāo)，它能夠從量化角度評(píng)價(jià)愈傷組織發(fā)生的最佳條件，誘導(dǎo)速度則從動(dòng)態(tài)變化的角度來衡量外植體愈傷發(fā)生與積累的快慢程度。以不同激素組合培養(yǎng)條件為自變量，以愈傷誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)速度為因變量進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如表4所示。

由單因素方差分析可知，不同激素組合培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)速度的效應(yīng)均為極顯著（F=71.509，P<0.01；F=48.008，P<0.01），圖3、圖4則比較直觀地反映出不同激素組合配比對(duì)銀杏葉片外植體愈傷誘導(dǎo)的差異性。從誘導(dǎo)的總體效果分析，除Ⅶ號(hào)處理外，其他各激素組合處理中銀杏葉片外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率均在80%以上，保持在一個(gè)相對(duì)較高的誘導(dǎo)水平。由此可見，銀杏葉片外植體細(xì)胞生理活性較強(qiáng)，比較容易脫分化誘導(dǎo)出愈傷組織，因而是愈傷組織誘導(dǎo)的良好材料。另外，從愈傷誘導(dǎo)指標(biāo)的協(xié)同性方面分析，以動(dòng)態(tài)變化為主要特征的誘導(dǎo)速度與以宏觀靜態(tài)為主要特征的愈傷誘導(dǎo)率之間，在誘導(dǎo)效果趨勢上表現(xiàn)出良好的協(xié)同一致性。Ⅳ處理愈傷誘導(dǎo)效果非常明顯，所有外植體均有效脫分化形成愈傷組織，誘導(dǎo)率最高達(dá)到100.00%，誘導(dǎo)速度為0.041 1個(gè)/d，表現(xiàn)出相應(yīng)的高水平狀態(tài)。

3 小結(jié)與討論

研究報(bào)道愈傷組織的形成和生長是受多種因素的影響，其中激素對(duì)植物離體培養(yǎng)中的細(xì)胞分化和形態(tài)建成具有明顯的調(diào)節(jié)作用[12]。植物激素對(duì)植物離體培養(yǎng)具有非常重要的調(diào)控作用，是愈傷組織誘導(dǎo)的主導(dǎo)因素，選擇合適的激素種類和濃度是愈傷組織誘導(dǎo)和生長的關(guān)鍵因素[13]。植物組織培養(yǎng)過程中，激素種類、濃度及其配比對(duì)于協(xié)調(diào)細(xì)胞生長、分化和代謝起重要作用。本研究以2，4-D、NAA、6-BA與KT 4種激素相互配比組合，形成多元化激素組合誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，分析不同培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體脫分化誘導(dǎo)愈傷組織的效應(yīng)大小與效應(yīng)方式。結(jié)果表明，不同激素組合培養(yǎng)條件對(duì)銀杏葉片外植體離體培養(yǎng)中膨大率、膨大速度、愈傷誘導(dǎo)率與誘導(dǎo)速度4個(gè)因變量的效應(yīng)均為極顯著，這種激素組合配比對(duì)外植體啟動(dòng)脫分化（膨大）與愈傷誘導(dǎo)效果的差異性分化，為銀杏葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)中最佳激素組配方式的篩選提供了前提。

綜合分析各效應(yīng)指標(biāo)，對(duì)于膨大率而言，Ⅳ處理和Ⅷ號(hào)表現(xiàn)出較優(yōu)的誘導(dǎo)效果，而對(duì)于膨大速度而言Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ處理之間基本持平，外植體啟動(dòng)脫分化速度相對(duì)較快；對(duì)于誘導(dǎo)率效應(yīng)指標(biāo)，Ⅳ處理所有外植體全部出愈，愈傷誘導(dǎo)率最高；且Ⅰ與Ⅳ處理在誘導(dǎo)速度變量上表現(xiàn)出相對(duì)優(yōu)勢，誘導(dǎo)速度較快，其余各組相對(duì)較慢。對(duì)比各處理誘導(dǎo)效果可知，對(duì)于處理Ⅶ而言，在試驗(yàn)測量的4個(gè)效應(yīng)指標(biāo)上均處于低水平狀態(tài)，可見此處理并不利于銀杏葉片外植體愈傷組織的誘導(dǎo)。綜合分析各激素組合處理的愈傷誘導(dǎo)率與速度，結(jié)合愈傷組織的品質(zhì)與生長積累量狀態(tài)，可以看出處理Ⅳ在各因變量指標(biāo)上均表現(xiàn)出高效應(yīng)，是銀杏葉片愈傷誘導(dǎo)的理想條件，即當(dāng)培養(yǎng)中激素組合培養(yǎng)條件為MS+2.0 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L NAA +0.3 mg/L 6-BA +1.0 mg/L KT時(shí)，銀杏葉片外植體脫分化誘導(dǎo)愈傷組織效果相對(duì)最佳。

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