摘要：以寬葉獨行菜（Lepidium latifolium L.）的葉片和莖段為外植體，接種于MS培養(yǎng)基上進行愈傷誘導(dǎo)和植株再生培養(yǎng)，研究不同濃度激素對愈傷和再生苗生長狀況的影響。結(jié)果表明，當(dāng)激素濃度為1.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L IAA +0.5 mg/L 6-BA時，再生植株長勢最好；當(dāng)激素濃度為0.5 mg/L 2，4-D +1.0 mg/L IAA +1.5 mg/L 6-BA時愈傷組織長勢最好；適當(dāng)增加6-BA的濃度，可以促進再生植株根系的生長。

關(guān)鍵詞：寬葉獨行菜（Lepidium latifolium L.）；組織培養(yǎng)；愈傷組織；外植體

中圖分類號：Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0213-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.056

寬葉獨行菜（Lepidium latifolium L.）為十字花科獨行菜族多年生草本植物，廣泛分布于中國北方的濱海及內(nèi)陸的鹽堿土上。該植物抗逆性強[1]，生長旺盛，是油菜進行抗逆育種的寶貴的遺傳資源[2-4]，也是一種極具開發(fā)前景的資源植物[5]。本研究對寬葉獨行菜進行組織培養(yǎng)并對組培體系進行初步優(yōu)化，以期為寬葉獨行菜的原生質(zhì)體培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化以及綜合利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

寬葉獨行菜，采自唐山地區(qū)。

1.2 培養(yǎng)基

以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 外植體消毒與接種 采集寬葉獨行菜的幼葉和嫩莖，用自來水沖洗，洗衣粉浸泡2～3 min，再用自來水沖洗干凈，置于超凈工作臺上進行常規(guī)消毒。先用1%的HCl2溶液浸泡5 min，無菌水沖洗2次，再用70%的乙醇浸泡0.5 min，無菌水沖洗2次，脫脂棉擦干備用。將寬葉獨行菜幼葉切成0.5 cm2大小的片段，嫩莖切成0.5～1.0 cm的小段，作為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體接種于盛有無菌培養(yǎng)基的三角瓶中。

1.3.2 2，4-D對寬葉獨行菜組培特性的影響 1～5號培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入3種外源激素2，4-D、IAA和6-BA，具體構(gòu)成如表1所示，其中IAA為1.0 mg/L，6-BA為0.5 mg/L，2，4-D為0.5～2.5 mg/L。每種培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，分裝在4個三角瓶中，冷卻后每個三角瓶接種3～4個外植體。

1.3.3 6-BA對寬葉獨行菜組培特性的影響 6～10號培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入3種外源激素6-BA、IAA和2，4-D，具體構(gòu)成如表2所示，其中IAA為1.0 mg/L，2，4-D為0.5 mg/L，6-BA為0.5～2.5 mg/L。每種培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，分裝在4個三角瓶中，冷卻后每個三角瓶接種3～4個外植體。

1.3.4 愈傷培養(yǎng)及植株再生 將接種有外植體的三角瓶置于溫度（25±2） ℃，光照度1 800～2 000 lx，光照時間12 h，空氣相對濕度40%～60%的條件下培養(yǎng)。每天觀察1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 2，4-D對寬葉獨行菜組培特性的影響

不同濃度2，4-D對寬葉獨行菜愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表1所示。當(dāng)2，4-D濃度為0.5～1.0 mg/L時，愈傷組織白、軟。當(dāng)2，4-D為1.5 mg/L時，愈傷組織長勢最好，寬葉獨行菜愈傷組織黃、軟，體量大。之后，隨著2，4-D濃度的增加，愈傷組織顏色變深，質(zhì)地變硬，長勢變差。

接種7 d之后，進入誘導(dǎo)期，接種的寬葉獨行菜葉片和莖段出現(xiàn)暗紅以及黃褐色（圖1a）。18 d后，外植體邊緣出現(xiàn)少量的愈傷組織（圖1b）。之后愈傷組織逐漸變大，并逐漸出現(xiàn)綠色小葉。24 d時，出現(xiàn)根系。35 d后，形成再生植株（圖1c）。1～5號培養(yǎng)基中寬葉獨行菜愈傷組織長出幼芽的時間逐漸變短，1號培養(yǎng)基中所需時間最長；3號和4號培養(yǎng)基中所需的時間最短，但4號培養(yǎng)基中的幼芽形態(tài)上沒有3號培養(yǎng)基中的表現(xiàn)好；5號培養(yǎng)基中幼芽長勢緩慢，基本處于停頓狀態(tài)。

2.2 6-BA對寬葉獨行菜組培特性的影響

不同濃度6-BA對寬葉獨行菜愈傷組織的誘導(dǎo)情況如表2所示。6號培養(yǎng)基與1號培養(yǎng)基激素構(gòu)成相同，所以當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時，寬葉獨行菜愈傷組織的表現(xiàn)和1號培養(yǎng)基中愈傷組織的表現(xiàn)相同。7號培養(yǎng)基中的愈傷組織與6號培養(yǎng)基中的愈傷組織表現(xiàn)相近，但長勢略好。當(dāng)6-BA為1.5 mg/L時，愈傷組織長勢最好，愈傷組織為淺黃色、軟、體量大。隨著6-BA濃度增加，9號和10號培養(yǎng)基中愈傷組織顏色逐級變深，質(zhì)地變硬，長勢變差。

寬葉獨行菜接種7 d之后，進入誘導(dǎo)期，接種的葉片和莖段出現(xiàn)暗紅以及黃褐色。18 d后，外植體邊緣出現(xiàn)少量的愈傷組織并伴隨有白色根須出現(xiàn)（圖2a）。之后寬葉獨行菜愈傷組織逐漸變大并出現(xiàn)綠色小葉，根系也更加明顯。35 d后，再生植株形成，可以明顯看出6-BA濃度較高時再生株的根系較為發(fā)達（圖2b、圖2c）。隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)出芽的速度也呈上升趨勢。6～10號培養(yǎng)基出芽時間呈遞減趨勢，但幼芽長勢上卻表現(xiàn)出不同，8號培養(yǎng)基中的幼芽長勢最好。

3 小結(jié)與討論

3.1 外植體的選擇

在寬葉獨行菜組培體系的建立中選擇了幼葉和嫩莖作為外植體，二者均經(jīng)過相同條件的消毒，但在之后的無菌培養(yǎng)過程中，嫩莖的污染率達到了18.8%，而幼葉的污染率僅有3.8%，二者差異明顯，可以排除是無菌操作過程中的污染造成的。初步懷疑是寬葉獨行菜莖中的內(nèi)生菌引起的污染。因為寬葉獨行菜是多年生植物，內(nèi)生菌易于積累[6]。所以在材料充足的條件下，應(yīng)盡可能采用寬葉獨行菜的幼葉來進行組織培養(yǎng)，以減少內(nèi)生菌的污染。

3.2 激素濃度的選擇

作為一種細胞分裂素，6-BA主要是促進芽的發(fā)育[7]。但試驗中隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織及再生植株的根系卻更加發(fā)達?？赡苁且驗樵囼炛屑毎至阉嘏c生長素之間的比例比較適合愈傷組織及再生植株根系的誘導(dǎo)生長。也有報道使用6-BA可以增加水稻不定根的數(shù)量[8]，增加玉米和黃瓜的根系生長量[9，10]。

以寬葉獨行菜愈傷組織和幼芽生長狀況來看，3號和8號培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。但8號培養(yǎng)基中的根系過于旺盛，3號培養(yǎng)基中的再生植株幼芽和根系的形態(tài)適宜。所以試驗中寬葉獨行菜組培體系的最適激素濃度為1.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L IAA+0.5 mg/L 6-BA。

參考文獻：

[1] CHEN H，QUALLS R G，BLANK R R. Effect of soil flooding on photosynthesis，carbohydrate partitioning and nutrient uptake in the invasive exotic Lepidium latifolium[J]. Aquatic Botany， 2005，82（4）：250-268.

[2] 徐傳遠，王麗萍，王 濤.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取寬葉獨行菜多糖工藝研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（5）：1176-1180.

[3] GROVER A，SINGH S，PANDEY P，et al.Overexpression of NAC gene from Lepidium latifolium L. enhances biomass， shortens life cycle and induces cold stress tolerance in tobacco： Potential for engineering fourth generation biofuel crops [J]. Mol Biol Rep， 2014， 41（11）：7479-7489.

[4] SINHA V B，GROVER A，SINGH S，et al. Overexpression of Ran gene from Lepidium latifolium L.（LlaRan） renders transgenic tobacco plants hypersensitive to cold stress[J]. Mol Biol Rep，2014，41（9）：5989-5996.

[5] 于瑞濤，趙曉輝，梅麗娟，等.寬葉獨行菜中脂肪酸的GC-MS分析[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012（24）：66-68.

[6] 鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進展[J].植物學(xué)報，2001， 43（9）：881-892.

[7] 劉 楊，王強盛，丁艷鋒，等.氮素和6-BA對水稻分蘗芽發(fā)育的影響及其生理機制[J].作物學(xué)報，2009，35（10）：1893-1899.

[8] 楊知建，徐慶國，朱 春，等.6-BA處理對水稻根系中后期生長的影響[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，35（5）：462-465.

[9] 肖長新，陳延玲，米國華.灌漿后期6-BA灌根對玉米衰老和產(chǎn)量形成的影響[J].玉米科學(xué)，2014，22（1）：103-107，113.

[10] 施和平，齊 瑩，張 悅，等.黃瓜毛狀根的誘導(dǎo)及細胞分裂素6-BA對其生長和形態(tài)的影響[J].生物工程學(xué)報，2006，22（3）：514-520.