摘要：以產(chǎn)β-甘露聚糖酶（MAN）的枯草芽孢桿菌HD145為目的菌株，PCR擴(kuò)增MAN基因片段，克隆到pHBM905A載體并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母，重組子利用甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)。純化的MAN酶解槐豆膠與瓜爾豆膠，質(zhì)譜檢測(cè)水解產(chǎn)物。SDS-PAGE結(jié)果表明，MAN基因?qū)崿F(xiàn)了表達(dá)，搖瓶酶活性為3 200 U/mL，酶最適溫度與pH分別為55 ℃與6.0，pH 4～7時(shí)穩(wěn)定性較好，在40、50、60 ℃的半衰期分別為165、105、42 min，Zn2+、Ag+、Co2+對(duì)酶活性存在一定的抑制?；倍鼓z與瓜爾膠經(jīng)MAN酶解后得到二糖至十糖的寡糖。

關(guān)鍵詞：甘露聚糖酶；克?。槐磉_(dá)；甘露寡糖

中圖分類號(hào)：Q939 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0176-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.046

甘露聚糖酶是一種內(nèi)切水解酶，特異性降解β-1，4糖苷鍵，底物包括甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及葡萄半乳甘露聚糖等，而這些底物是組成植物半纖維素的第二大組分，所以甘露聚糖酶在飼料、畜牧生產(chǎn)、食品保健、造紙及紡織等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景[1，2]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)甘露聚糖酶的研究主要集中在從環(huán)境中篩選產(chǎn)酶菌株[3，4]，對(duì)菌種進(jìn)行誘導(dǎo)育種[5]，優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)酶工藝[6，7]，將酶基因克隆在芽孢桿菌[8]、大腸桿菌[9，10]及畢赤酵母[11]中異源表達(dá)等方面。甘露寡糖是甘露聚糖酶水解以上底物產(chǎn)生的產(chǎn)物，在醫(yī)藥、功能性食品、保健領(lǐng)域表現(xiàn)出獨(dú)特的活性，已成為研究熱點(diǎn)[12]。能被甘露聚糖酶降解的底物來源主要有魔芋（葡甘聚糖）、田菁膠（半乳甘露聚糖）、槐豆膠（半乳甘露聚糖）及瓜爾膠（半乳甘露聚糖）。目前，國(guó)內(nèi)研究的對(duì)象主要是魔芋[13，14]，而對(duì)于槐豆膠與瓜爾膠的酶解研究相對(duì)較少。

本試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌甘露聚糖酶基因進(jìn)行克隆并在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，提高酶活性，再以槐豆膠與瓜爾膠為對(duì)象進(jìn)行酶解，分析產(chǎn)物組分，為工業(yè)化生產(chǎn)甘露寡糖及寡糖的功能開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 枯草芽孢桿菌HD145與大腸桿菌XL10-Gold由湖北大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。畢赤酵母GS115菌株購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，在pPIC9K上進(jìn)行改造得到質(zhì)粒pHBM905A?；倍鼓z與瓜爾膠購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 試劑和儀器 限制性內(nèi)切酶購(gòu)于寶生物工程（大連）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)于上海碧云天生物公司，其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司?；|(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，購(gòu)于美國(guó)布魯克道爾頓公司。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體pHBM905A-man的構(gòu)建 設(shè)計(jì)引物pBS-F（GTCACATACTGTGTCGCCTGTGAATCC，下劃線部分含CpoⅠ黏性末端）與pBS-R（GGCCATCACTCAACGATTGGCGTTAAAG，下劃線部分含NotⅠ黏性末端），以枯草芽孢桿菌HD145總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s ，72 ℃延伸35 s；25個(gè)循環(huán)）。擴(kuò)增產(chǎn)物在含dTTP的體系中經(jīng)T4 DNA聚合酶消化15～20 min，形成CpoⅠ與NotⅠ黏性末端，再與P.pastoris表達(dá)載體pHBM905A連接（pHBM905A預(yù)先經(jīng)CpoⅠ與NotⅠ消化），重組載體記為pHBM905A-man，詳細(xì)構(gòu)建過程參考文獻(xiàn)[15]。pHBM905A-man轉(zhuǎn)化E. coli XL10-Gold，經(jīng)菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化 重組載體pHBM905A-man經(jīng)SalⅠ線性化處理，電轉(zhuǎn)P. pastoris GS115（7 500 V/cm， 25 lF， 400 X，Bio-Rad Gene Pulser， USA）。陽性重組子在MD培養(yǎng)基上經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證。

1.2.3 甘露聚糖酶重組表達(dá) 挑取活性高的酵母重組子，在100 mL BMGY中 28 ℃ 培養(yǎng) 2 d，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min收集菌體，轉(zhuǎn)入BMMY中25 ℃甲醇誘導(dǎo)，過程參考Pichia Expression Kit操作手冊(cè)。

1.2.4 酶活性測(cè)定 甘露聚糖酶測(cè)定參考文獻(xiàn)[16]。

1.2.5 重組酶純化 誘導(dǎo)液在4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，于75%硫酸銨4 ℃過夜，12 000 r/min離心15 min，收集沉淀，溶解于50 mmol/L pH 6.0醋酸鈉緩沖液中，轉(zhuǎn)入45 cm Sephadex G-100柱（Pharmacia），收集液體，用于性質(zhì)分析。

1.2.6 酶性質(zhì)分析 在pH 2.0～10.0范圍內(nèi)，分別用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH 2.0～6.0）、磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（pH 6.0～8.0）及甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 8.0～10.0）測(cè)定酶的最適反應(yīng)pH；在30～90 ℃范圍內(nèi)，測(cè)定酶的最適反應(yīng)溫度。

酶pH穩(wěn)定性測(cè)定：先將酶在不同的pH緩沖液中保留一定時(shí)間，再調(diào)回到最適pH，測(cè)定酶殘留活性。分別在40、50、60 ℃條件下保留不同的時(shí)間，測(cè)定酶熱穩(wěn)定性。

金屬離子對(duì)酶活性的影響：將酶在10 mmol/L不同金屬離子體系（100 mmol/L醋酸鈉，pH 5.5，室溫） 中保留1 h，測(cè)定酶活性。

1.2.7 甘露寡糖酶解制備 分別于pH 5.0、6.0、7.0、8.0條件下，配制2%的槐豆膠及瓜爾膠底物，按底物∶酶=1∶20（質(zhì)量比）添加酶液，于50 ℃反應(yīng)過夜，檢測(cè)酶解產(chǎn)物。

1.2.8 酶解產(chǎn)物分析 甘露寡糖酶解產(chǎn)物的檢測(cè)應(yīng)用質(zhì)譜儀（Ultraflex Ⅱ MALDI-TOF/TOF，反射模式）進(jìn)行分析。酶解液于12 000 r/min 4 ℃離心15 min，吸取15 μL上清液與等體積的55%乙醇混勻，從混合液中吸取5 μL再與等體積的2，5-二羥基苯甲酸基質(zhì)混勻，利用質(zhì)譜儀對(duì)混勻液進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴(kuò)增

以芽孢桿菌總DNA為模板，利用引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到與預(yù)計(jì)大小相符，約1 011 bp的目的MAN基因片段（圖1）。

2.2 重組蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)

挑選陽性酵母重組子（pHBM905A-man）進(jìn)行搖瓶表達(dá)，以不含目的基因的轉(zhuǎn)化子（pHBM905A）為負(fù)對(duì)照，甲醇誘導(dǎo)120 h后，離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R250染色，觀察電泳結(jié)果。如圖2所示，在陽性重組子泳道約41 ku大小處有一明顯條帶，分子質(zhì)量與預(yù)期相符，且純度較高，而在陰性對(duì)照泳道，不含任何條帶，說明目的基因?qū)崿F(xiàn)了表達(dá)，搖瓶甘露寡糖酶活性為3 200 U/mL。

2.3 酶學(xué)特性

純化后的重組酶最適pH與溫度分別為6.0與55 ℃，在pH 4～7穩(wěn)定性較好；在40、50、60 ℃的半衰期分別為165、105、42 min，如圖3所示。在10 mmol/L的金屬離子下，Zn2+、Co2+和Ag+對(duì)重組酶活性存在一定的抑制作用，如表1所示。

2.4 酶解產(chǎn)物分析

試驗(yàn)結(jié)果表明，槐豆膠與瓜爾膠在pH 6條件下能較好地水解，其酶解產(chǎn)物經(jīng)離心后，上清液于質(zhì)譜條件下分析，根據(jù)質(zhì)核比（m/z）推測(cè)產(chǎn)物組分，結(jié)果如圖4所示。兩者都能被重組酶水解生成寡糖，槐豆膠的酶解產(chǎn)物組分主要是5～11糖及少量的2～4糖，瓜爾膠的酶解產(chǎn)物是2～11糖。

3 討論

目前甘露聚糖酶的應(yīng)用主要是通過底物誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生，但酶活性、產(chǎn)量及純度不高，不適于工業(yè)化應(yīng)用，所以酶基因的克隆表達(dá)成為研究熱點(diǎn)，而由于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，成為表達(dá)宿主的首選，已有芽孢桿菌[11，17，18]、曲霉[14，16，19，20]、青霉[21]等不同微生物的MAN基因在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。本試驗(yàn)將篩選獲得的枯草芽孢桿菌MAN基因克隆在畢赤酵母中，實(shí)現(xiàn)了高活性表達(dá)，與上述重組酶在酶活性、催化溫度、pH、穩(wěn)定性及金屬離子影響性等方面表現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)，為工業(yè)化酶的應(yīng)用提供了新的資源與選擇。

關(guān)于MAN酶解槐豆膠與瓜兒膠制備甘露寡糖的研究相對(duì)較少，目前只有少量在瓜兒膠水解方面的報(bào)道[22，23]。本試驗(yàn)對(duì)兩種底物進(jìn)行酶解，為甘露聚糖酶的功能開發(fā)提供新的思路，后期對(duì)酶解工藝及控制進(jìn)行優(yōu)化，制備不同分子質(zhì)量范圍的寡糖，可提高寡糖的應(yīng)用價(jià)值。

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