摘要：通過確定Na2S2O4對EA.hy926細胞造成缺氧損傷的最佳濃度和時間點建立缺氧損傷模型，以只加Na2S2O4為對照組，添加不同濃度的苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）粗提物，從細胞形態(tài)和細胞生存率兩個方面檢測其抗缺氧作用，分析苞葉雪蓮粗提物對Na2S2O4造成EA.hy926細胞缺氧損傷的保護作用。結(jié)果表明，苞葉雪蓮粗提物從1.25 mg/mL濃度開始呈劑量依賴性的增加了缺氧模型組中EA.hy926細胞的相對存活率，在10 mg/mL濃度下與Na2S2O4模型組相比，極顯著增加了細胞存活率，是缺氧模型組的6.3倍，表明苞葉雪蓮具有很強的抗缺氧損傷能力。

關(guān)鍵詞： 苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）；EA.hy926細胞；缺氧損傷

中圖分類號：R282 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0167-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.044

高原環(huán)境因其海拔原因具有氣壓低、氧氣稀薄、空氣干燥、氣候寒冷、紫外線照射強烈等一系列惡劣條件，并隨著海拔的升高這些條件進一步惡化，為高原地區(qū)人們的生活、工作及身體健康造成負面影響。目前，國內(nèi)外學者普遍認為，長期暴露在缺氧環(huán)境中會對人的認知功能產(chǎn)生一些影響，如感知覺、記憶力、思維力和注意力的下降等，并且對情緒情感和心理運動能力都有負面反應(yīng)[1]。苞葉雪蓮（Saussurea obvallata）是菊科風毛菊屬的植物。分布在印度、錫金、尼泊爾、克什米爾以及中國大陸的云南、甘肅、四川、西藏、青海等地，生長于海拔3 200～4 700 m的地區(qū)，在藏藥中用于治療癲狂、中風、腦溢血和偏癱等神經(jīng)性疾病[2]，現(xiàn)在學者認為苞葉雪蓮水提物對小鼠的免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)及整體水平具有輻射防護作用[3-5]。本試驗通過確定連二硫酸鈉（Na2S2O4）對EA.hy926細胞造成缺氧損傷的最佳濃度和時間點建立缺氧損傷模型，以只加Na2S2O4為對照組，添加不同濃度的苞葉雪蓮粗提物，從細胞形態(tài)和細胞生存率兩個方面檢測其抗缺氧作用，探討苞葉雪蓮粗提物是否具有對Na2S2O4造成EA.hy926細胞缺氧損傷的保護作用，為進一步細分該藥中抗缺氧具體成分奠定基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株

EA.hy926細胞株購于中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥材與試劑

苞葉雪蓮粗提物：苞葉雪蓮于2013年8月采自青海省貴德縣，經(jīng)青海省食品藥品檢驗所藏藥室駱桂法研究員鑒定，為菊科風毛菊屬苞葉雪蓮全草。將采集的苞葉雪蓮研磨成粗粉經(jīng)90%乙醇熱回流提取，提取液濃縮至流浸膏（相當于10 g/mL生藥），使用時用生理鹽水稀釋；連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）、三氯乙酸（TCA），國藥集團化學試劑有限公司；培養(yǎng)基（DMEM）、96孔板、培養(yǎng)瓶，Corning公司；胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶[0.25% Trypsin-EDTA（1×）]，Gibco公司；二甲基亞砜、磺酰羅丹明B（SRB），Sigma公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞的培養(yǎng) 復蘇EA.hy926細胞，置于37 ℃，5% CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中，用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化，在細胞處于對數(shù)生長期時進行試驗。

1.3.2 缺氧模型的建立 將EA.hy926細胞10 000～20 000/孔接種于96孔板中，檢測Na2S2O4造成細胞缺氧狀態(tài)的最佳濃度，Na2S2O4可以很快清除緩沖液里的氧，使溶液氧含量為零。Na2S2O4用生理鹽水配制成100 mmol/L母液，參考文獻[6-9]以終濃度8 mmol/L為首濃度，2倍稀釋，共做7個濃度，作用24 h。IncuCyte鏡下觀察細胞形態(tài)，用SRB法計算不同濃度的Na2S2O4對EA.hy926細胞的抑制率及半數(shù)抑制濃度IC50。首先，棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μL濃度為30%的預(yù)冷TCA，置于4 ℃ 1 h固定細胞，用去離子水洗滌5次后，晾干，之后每孔加入100 μL濃度為0.04 mg/mL磺酰羅丹明B（SRB，1%冰醋酸配制）染色15 min，染色結(jié)束后用1%冰醋酸洗滌5次，去除未與細胞結(jié)合的SRB，晾干，最后每孔用10 mmol/L的Tris-base溶液150 μL溶解染料，置于搖床上至染料完全溶解均勻后，用酶標儀在560 nm波長下讀取OD560 nm，抑制率=（對照組OD560 nm -給藥組OD560 nm）/對照組OD560 nm×100%。IC50通過四參數(shù)曲線擬合法計算。通過以上結(jié)果選定最佳破壞劑量和時間，拍照記錄，選定模型濃度，用以進行后續(xù)試驗。

1.3.3 細胞分組及檢測 檢測苞葉雪蓮粗提物對缺氧狀態(tài)下細胞的保護作用，將EA.hy926細胞10 000～20 000/孔接種于96孔板中，細胞分為三組，陰性對照組、缺氧模型組和加藥組。加藥組加入苞葉雪蓮粗提物，以10 mg/mL為首濃度，2倍稀釋，共8個濃度，粗提物用二甲基亞砜（DMSO）溶解后用生理鹽水稀釋成試驗所需濃度，加藥后確保DMSO終濃度<0.1%，加入96孔板中預(yù)孵育2 h后，加入8 mmol/L的Na2S2O4建立細胞缺氧模型，作用24 h。IncuCyte鏡下觀察細胞形態(tài)學變化并拍照記錄。達到最佳破壞時間后用SRB法檢測細胞的相對存活率，相對存活率=給藥組或缺氧模型組OD560 nm /陰性對照組OD560 nm×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析結(jié)果，組間差異采用兩樣本均數(shù)比較t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2S2O4對EA.hy926細胞存活的抑制結(jié)果

在EA.hy926細胞中加入不同濃度Na2S2O4作用24 h后，高濃度組細胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細胞停止增殖、細胞膜皺縮、細胞形態(tài)不規(guī)則、部分細胞懸浮未貼壁、黑色代謝產(chǎn)物增加等（圖1）。與對照組相比，細胞的生存能力劑量依賴性的減弱，說明Na2S2O4對EA.hy926細胞的增殖具有抑制作用，用SRB法檢測抑制率可以看出，當Na2S2O4濃度降到2 mmol/L以下時，對細胞無明顯的抑制作用（表1，圖1）。根據(jù)不同濃度抑制率做四參數(shù)曲線擬合計算出Na2S2O4的IC50為3.021，表明在3 mmol/L Na2S2O4下抑制了50%細胞的生存能力，因此在實際過程中選用大于IC50的濃度8 mmol/L進行后續(xù)試驗，抑制率為88.81%，可以更大程度地體現(xiàn)出苞葉雪蓮粗提物的保護作用。

2.2 苞葉雪蓮粗提物對Na2S2O4造成細胞缺氧的保護作用

在EA.hy926細胞上用8 mmol/L Na2S2O4造成缺氧模型之后，加入不同濃度的苞葉雪蓮粗提物，從細胞存活率和細胞形態(tài)兩個方面觀察其保護作用。苞葉雪蓮粗提物10.00 mg/mL濃度下可極顯著增加缺氧細胞的存活率（P<0.01），與對照組相比的相對存活率是缺氧模型組的6.3倍，說明在該濃度下缺氧導致的細胞凋亡和增殖抑制這些負面作用被苞葉雪蓮粗提物大部分中和，與缺氧模型組相比具有極顯著差異（表2）。5.00、2.50 mg/mL苞葉雪蓮粗提物可以保護細胞，與缺氧模型組相比，相對存活率增加，差異達到顯著水平（P<0.05）；當苞葉雪蓮粗提物濃度下降到1.25 mg/mL以下時，保護作用不明顯。

從細胞形態(tài)學變化上觀察，苞葉雪蓮粗提物可劑量依賴性地保護細胞，免于缺氧造成的細胞凋亡、萎縮、增殖抑制，其中10.00 mg/mL濃度下保護作用最為明顯，細胞形態(tài)基本完整，懸浮較少，細胞代謝產(chǎn)物相對減少，細胞融合率顯著增加。降低濃度后苞葉雪蓮粗提物仍可以保護細胞形態(tài)完整，這種保護作用在0.08 mg/mL濃度下仍可從拍照圖片中觀察出（圖2）。

3 小結(jié)

苞葉雪蓮粗提物從1.25 mg/mL濃度開始呈劑量依賴性地增加了缺氧模型組中EA.hy926細胞的相對存活率，在10.00 mg/mL濃度下與Na2S2O4模型組相比，極顯著增加了細胞相對存活率，是缺氧模型組的6倍以上，表明苞葉雪蓮具有很強的抗缺氧損傷能力。這一結(jié)果在動物試驗中已經(jīng)初步得到了驗證，其主要作用成分值得進一步分化探討，力求得到抗缺氧有效的單一組分，在臨床應(yīng)用中明確其成分，確定使用劑量和安全性。

參考文獻：

[1] 楊國愉，馮正直，汪 濤.高原缺氧對心理功能的影響及防護[J]. 中國行為醫(yī)學科學，2003（4）：116-118.

[2] 田淑琴，張 琦，劉述皇，等.苞葉雪蓮的藥理研究[J].中藥新藥與臨床藥理，1998（3）：42-43，64.

[3] 畢良文，李文輝，段 偉，等.苞葉雪蓮水提物對輻射損傷小鼠防護作用的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2009，17（7）：1218-1221.

[4] 郭 娜，李文輝，張國良，等.苞葉雪蓮水提物對小鼠生殖細胞輻射防護作用的研究[J].中國輻射衛(wèi)生，2010（4）：394-396.

[5] 張國良，李文輝，郭 娜，等.苞葉雪蓮水提物對小鼠免疫系統(tǒng)輻射防護作用的研究[J].中國輻射衛(wèi)生，2011（2）：135-136，139.

[6] 許蜀閩，王培勇，馬紅英.連二亞硫酸鈉在建立培養(yǎng)細胞的無氧環(huán)境中的應(yīng)用[J].第三軍醫(yī)大學學報，2005（4）：359-360.

[7] 胡海燕，崔志慧，陳 翔，等.清心開竅方含藥腦脊液對連二亞硫酸鈉所致PC12細胞損傷的保護機制研究[J].中國中藥雜志，2013（9）：1314-1317.

[8] SUN J， LI Y Z，DING Y H，et al. Neuroprotective effects of gallic acid against hypoxia/reoxygenation-induced mitochondrial dysfunctions in vitro and cerebral ischemia/reperfusion injury in vivo[J].Brain Research， 2014，1589（17）：126-139.

[9] AHN K，PAN S， BENINGO K，et al. A permanent human cell line（EA.hy926） preserves the characteristics of endothelin converting enzyme from primary human umbilical vein endothelial cells[J].Life Sciences，1995，56（26）：2331-2341.