摘要：以斑點叉尾鮰（Ietalurus punetaus）魚皮為原料，采用響應(yīng)面法對膠原蛋白熱水法提取工藝進行優(yōu)化。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert軟件對提取溫度、提取pH與料液比進行三因素響應(yīng)面試驗，以膠原蛋白得率為響應(yīng)值優(yōu)化熱水法提取條件，并驗證響應(yīng)面預(yù)測值與實測值的一致性。膠原蛋白最佳提取工藝條件為提取溫度100 ℃、提取pH為6、料液比1∶10（g∶mL），膠原蛋白得率為16.98%。實測值與響應(yīng)面預(yù)測值擬合良好，說明通過響應(yīng)面試驗設(shè)計對熱水法提取膠原蛋白的優(yōu)化是有效的。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；斑點叉尾鮰（Ietalurus punetaus）；魚皮；膠原蛋白；熱水提取法

中圖分類號：TS254.9 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0157-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.042

Optimization of Collagen Extraction of Ietalurus punetaus Skin

by Response Surface Method

HUANG Wen1，ZHOU Qiu-shu2，YUAN Chun-hong3，XU Meng1，ZHAO Qi-meng1，XU Cheng1，BAO Jian-qiang1

（1.College of Food， Shanghai Ocean University/Shanghai Ocean University Aquatic Animal Breeding Center， Shanghai 201306， China；

2.Yantai University， Yantai 264005， Shandong， China；3. Department of Aquatic Products，Kagoshima University， Kagoshima 8900056，Japan）

Abstract： Response surface methodology was applied to optimize the extraction conditions of collagen by heating in water in fish skin of channel catfish （Ietalurus punetaus）. On the basis of single factor tests， response surface analysis was designed by Design-Expert and the effects of extraction temperature，extraction hydrogen ion concentration and extraction ratio of material to water on the yield of collagen were investigated，and the predicted value and measured value were also contrasted. The results showed the optimal extraction conditions as follows： the extraction temperature was 100 ℃，extraction hydrogen ion concentration was 6，extraction ratio of material to water was 1∶10（g∶mL）. Under these conditions，the yield of collagen was 16.98%，which was consistent with the predicted value. It showed that the experiment was effective.

Key words： response surface methodology； Ietalurus punetaus； fish skin； collagen； extraction by heating in water

中國擁有豐富的水產(chǎn)資源，在魚類產(chǎn)品加工過程中大量魚皮被作為下腳料廢棄，所產(chǎn)生的廢棄物數(shù)量龐大。這些廢棄物中含有大量的膠原蛋白，膠原蛋白是一種生物性高分子物質(zhì)，也是一種功能性蛋白，廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化妝品、生物醫(yī)學(xué)等行業(yè)以及科學(xué)研究領(lǐng)域等[1]。膠原蛋白是一種絲狀蛋白纖維，可以保持皮膚的彈性，存在于人體的皮膚、骨骼、牙齒、肌腱等部位，用于粘合結(jié)締組織。在魚類的骨骼和結(jié)締組織中也含有膠原蛋白[2]，在真皮、骨、腱、鱗中含量較多[3]。從魚皮中提取膠原蛋白可以提高魚產(chǎn)品加工的附加值，產(chǎn)生更多的經(jīng)濟效益，促進漁業(yè)的長足發(fā)展[4]。

目前，膠原蛋白提取方法有四種：酶法、酸堿法、鹽法、熱水法[5]。馬儷等[6]在優(yōu)化酶提取鱈魚皮的膠原蛋白得率的研究中，得出鱈魚皮中膠原蛋白的最佳提取條件是溫度16.32 ℃下水解10.43 h，酶濃度0.054%，得率可達到27.53%。在酸法提取鮰魚皮膠原蛋白試驗中，陳麗麗等[7]從酸種類、濃度、固液比、提取溫度和時間方面對得率的影響進行了分析，得出最佳提取條件是以0.5 mol/L的醋酸為浸提劑，固液比為1∶50，在15 ℃提取72 h，得率達到62.05%。在優(yōu)化羅非魚皮膠原蛋白提取條件的研究中，林家福等[8]考察了不同溫度、pH、提取時間和液固比等方面對得率的影響，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)提取條件為溫度90 ℃、pH 6.0，固液比1∶13，作用時間2 h，羅非魚魚皮膠原蛋白的得率達到212 mg/g。由此可見，熱水提取法的成本較其他方法低且簡單，所獲附加值較高。

斑點叉尾鮰（Ietalurus punetaus）是美國最重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類之一[9]。自1984年引入中國已推廣到20多個省市，成為中國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟魚類之一[10]，其養(yǎng)殖范圍大，產(chǎn)量高。因此，本試驗選取斑點叉尾鮰為原料，借助響應(yīng)面法探究熱水法提取鮰魚皮膠原蛋白的最優(yōu)條件，并制成膠原蛋白凍，為商業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮冷凍斑點叉尾鮰魚皮，由安徽富煌三珍食品集團有限公司提供；羥脯氨酸試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；品牌1果凍、品牌2果凍、品牌3果凍，購自上海農(nóng)工商超市；其他化學(xué)試劑均為分析純。

UV-18OOPC型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；TA-XT plus型質(zhì)構(gòu)儀（英國Stable Micro System公司）；MINIFAST-04型真空冷凍干燥機（美國BOC EDWARDS公司）。

1.2 預(yù)處理

使用前將保存在-51 ℃的斑點叉尾鮰魚皮置于流動的冷水中解凍，融化后用手術(shù)刀切成5 mm×5 mm大小的碎片，放入冰水中使用磁力攪拌器反復(fù)攪拌魚皮直至冰水變?yōu)榍宄?。? ℃條件下，用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡20 min，去除脂肪和部分雜蛋白。之后用去離子水反復(fù)清洗魚皮去除殘留的污垢以及NaOH。在10 ℃以下使用2倍體積的正己烷浸泡魚皮6 h使魚皮脫脂。最后用冷水洗去有機溶劑，將處理好的魚皮放入真空冷凍干燥機，干燥后放入-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆肹11]。

1.3 熱水提取膠原蛋白制備工藝

將凍干的魚皮稱量后放入燒杯，加入一定比例的去離子水，將燒杯口用鋁箔紙封住防止水分蒸發(fā)。在一定的溫度、時間、pH和料液比的條件下，水浴加熱提取魚皮膠原蛋白溶液。用布氏漏斗抽濾裝置進行真空抽濾，再用濾布濾掉殘渣。最后將魚皮膠液放入低溫培養(yǎng)箱（15 ℃）中凝凍16 h[12]。

1.4 單因素試驗

1.4.1 提取溫度對斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白得率和凍力的影響 提取時間固定為2 h，提取pH設(shè)定為7，料液比（干魚皮∶去離子水=m∶V，g∶mL，下同）為1∶10。設(shè)定4個不同的溫度條件，分別為70、80、90、100 ℃，測定魚皮膠原蛋白得率和凍力。

1.4.2 提取時間對斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白得率和凍力的影響 提取pH固定為7，料液比為1∶10，提取溫度設(shè)定為90 ℃。設(shè)定4個不同的提取時間，分別為1、2、3、4 h，測定魚皮膠原蛋白得率和凍力。

1.4.3 提取pH對斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白得率和凍力的影響 提取料液比固定為1∶10，提取溫度設(shè)定為90 ℃，提取時間設(shè)定2 h。配制4個不同的提取pH，分別為4、5、6、7，測定魚皮膠原蛋白得率和凍力。

1.4.4 提取料液比對斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白得率和凍力的影響 提取溫度設(shè)定為90 ℃，提取時間設(shè)定為2 h，提取pH設(shè)定為7。配制5種不同的料液比，分別為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14，測定魚皮膠原蛋白得率和凍力。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取溫度、提取pH和料液比對斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白得率的影響較大。建立Box-Behnken模型[13]，選取提取溫度（A）、pH（B）和料液比（C）為自變量，以膠原蛋白得率Y為響應(yīng)值設(shè)計三因素三水平二次回歸方程試驗，擬合自變量與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，響應(yīng)面試驗因素和水平見表1。

1.6 測定方法

1.6.1 基本成分分析 水分測定按照GB 5009.3-2010中直接干燥法（105 ℃）；灰分測定按照GB 5009.4-2010中灼燒恒重法（550 ℃）；蛋白質(zhì)測定按照GB 5009-2010中凱氏定氮法（轉(zhuǎn)換系數(shù)取6.25）；脂肪測定按照GB/T 14772-2008中索氏抽提法；總糖測定采用蒽酮-硫酸比色法。

1.6.2 氨基酸組成測定 用鹽酸水解后，按照GB/T 5009.124-2003用氨基酸全自動分析儀測定。

1.6.4 凍力測定 將制成的魚皮膠液和水浴加熱后的液體果凍取110 mL置入凍力瓶（內(nèi)徑59 mm，高度85 mm），放進15 ℃的低溫培養(yǎng)箱中凝凍16 h，壓縮變形4 mm所需的最大應(yīng)力為凍力，單位為g。采用質(zhì)構(gòu)儀測定，測定條件為P/0.5探頭，下壓速度1 mm/s，下壓高度4 mm[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本成分分析

以魚皮濕重計，斑點叉尾鮰的基本成分為水分61.37%±0.32%、灰分0.48%±0.11%、粗蛋白27.48%±0.21%、粗脂肪10.21%±0.51%、總糖0.41%±0.12%，可見斑點叉尾鮰魚皮的蛋白質(zhì)含量豐富，含糖量低。

2.2 氨基酸組成分析

斑點叉尾鮰魚皮水解溶液的氨基酸分析結(jié)果中，羥脯氨酸含量為（230.126 5±4.839 5） ng，脯氨酸含量為（1 152.63±39.23） ng、。羥脯氨酸和脯氨酸都是膠原蛋白的主要成分，其中羥脯氨酸是膠原蛋白的特異性氨基酸[16]，在其他蛋白中十分少見，含量也較為穩(wěn)定。斑點叉尾鮰魚皮中膠原蛋白含量豐富，是良好的新型膠原蛋白資源。

2.3 單因素試驗結(jié)果

以斑點叉尾鮰魚皮的膠原蛋白得率為主要參考指標(biāo)，膠原蛋白制成魚皮凍的凍力為次要參考指標(biāo)。魚皮凍力的標(biāo)準(zhǔn)有別于膠原蛋白明膠制品在凝膠強度上的要求，在一定凝膠強度的基礎(chǔ)上考慮更多的是咀嚼口感[12]。魚皮凍要求有良好的適口感，本試驗中以市場中普通品牌的果凍作為參考指標(biāo)，普通品牌果凍凍力品牌1為（39.8±0.51） g、品牌2為（39.02±0.53） g、品牌3為（41.42±0.47）g，平均值為（40.08±1.22） g。

2.3.1 提取溫度對魚皮膠原蛋白提取的影響 由圖1可見，在一定范圍內(nèi)，溫度上升魚皮膠原蛋白得率和凍力都在增加。當(dāng)溫度升至90 ℃時，膠原蛋白得率和凍力到達最大值。隨著溫度繼續(xù)升高，膠原蛋白得率略微有下降，而凍力下降明顯。溫度越高膠原蛋白溶液越容易轉(zhuǎn)變成明膠。90 ℃之后膠原蛋白得率略有下降可能是高溫對蛋白質(zhì)的破壞作用，所以膠原蛋白得率在溫度達到100 ℃時略有下降。由于高溫使得膠原溶液中α肽鏈增加且肽鏈之間相互交聯(lián)度隨之上升，形成了更密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。隨后溫度繼續(xù)升高造成肽鏈的次級降解增加，短肽鏈難以交聯(lián)形成密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，交聯(lián)度下降，導(dǎo)致凍力在90 ℃升到最大值之后開始下降。所以，斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白提取的最佳提取溫度為90 ℃。

2.3.2 提取時間對魚皮膠原蛋白提取的影響 由圖2可見，隨著提取時間的增加膠原蛋白得率持續(xù)增加。提取時間越長，魚皮中溶出的膠原蛋白越多。凍力在提取2 h之后增加到最大值，之后隨著時間延長而降低。這是由于提取時間的增加使得次級肽鏈的降解增加，導(dǎo)致凍力下降。當(dāng)提取時間達2 h時膠液的凍力已符合本試驗的參考指標(biāo)，且膠原蛋白得率隨著時間的增加變化不明顯，綜合考慮實際生產(chǎn)的能耗和效率，響應(yīng)面試驗設(shè)計中沒有加入時間因素作為研究。

2.3.3 提取pH對魚皮膠原蛋白提取的影響 圖3結(jié)果顯示，在酸性條件下膠原蛋白得率隨著pH的升高而增加，中性偏酸pH=6時得率最高，中性條件得率有所下降。在酸性溶液中，部分溶解的蛋白質(zhì)被水解成氨基酸[8]。凍力隨著pH的升高而增加，明膠分子的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定使得凝膠特性增強。調(diào)制pH=6之后凍力開始下降，是因為膠原溶出量減少導(dǎo)致濃度降低，凍力隨之減小。所以，斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白提取的最佳提取pH為6。

2.3.4 料液比對魚皮膠原蛋白提取的影響 由圖4可見，當(dāng)料液比為1∶6、1∶8、1∶10時，膠原蛋白得率隨著加水量的增加而呈線性增長。當(dāng)加水量達到10倍體積時，膠原蛋白得率達到最大值，之后隨加水量增加而減小。這可能是因為在單位時間內(nèi)相同條件下魚皮中膠原蛋白溶出的速率是一定的，溶液體積增加會降低其濃度，從而導(dǎo)致得率略微下降，實際生產(chǎn)中加水量過多會增加能耗。凍力則隨著加水量增加而降低，這是因為料液比直接影響了溶液中膠原蛋白的濃度。所以，斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白提取最優(yōu)料液比為1∶10，此條件下魚皮凍凍力為38.54，達到適口感的參考指標(biāo)。

2.4 響應(yīng)面試驗

2.4.1 模型的建立與分析 以提取溫度、提取pH和料液比為試驗因素，膠原蛋白得率為評價指標(biāo)，按照二次項回歸方程進行試驗[11]，試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。針對表2應(yīng)用Design-Expert V8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得出提取時間（A）、提取pH（B）、料液比（C）與響應(yīng)值膠原蛋白得率（Y）的關(guān)系，其方程式為：

Y=17.14+1.10A+0.50B-0.48C-0.075AB-0.13AC-0.075BC-0.88A2-1.48B2-1.13C2。

由響應(yīng)面試驗結(jié)果進行回歸模型的方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3顯示，試驗?zāi)Ｐ偷腜值為0.000 2<0.01，模型極顯著，失擬項P值為0.453 8>0.05，表示試驗數(shù)據(jù)和模型擬合良好。對P的檢驗可以得出，提取溫度、提取pH和料液比以及各二次項對膠原蛋白得率的影響都是顯著的。模型的復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.967 0，調(diào)整后的R2=0.924 7。由此可知，模型能夠很好地反映膠原蛋白得率與提取溫度、提取pH和料液比之間的關(guān)系，并且可以用來對膠原蛋白得率進行優(yōu)化分析和預(yù)測。

2.4.2 提取條件的優(yōu)化與驗證 在提取料液比為1∶10的條件下提取2 h，提取溫度與提取pH對膠原蛋白得率的影響如圖5所示。通過對P檢驗得出，提取溫度與提取pH的交互作用對膠原蛋白得率的影響不顯著，當(dāng)料液比為1∶10、提取溫度96.20 ℃、pH為6.11時，膠原蛋白得率可達到17.52%。

在提取pH為6的條件下提取2 h，提取溫度與料液比對魚皮膠原蛋白得率的影響如圖6所示。通過對P檢驗得出，提取溫度與料液比的交互作用對膠原蛋白得率的影響不顯著，當(dāng)pH為6、提取溫度為96.48 ℃、料液比為1∶10時，膠原蛋白得率可達到17.55%。

在提取溫度為90 ℃的條件下提取2 h，提取pH與料液比對魚皮膠原蛋白得率的影響如圖7所示。通過對P值檢驗得出，提取pH與料液比的交互作用對膠原蛋白得率的影響不顯著，當(dāng)提取溫度為90 ℃、pH為6.17、料液比為1∶10時，膠原蛋白得率可達到17.23%。

利用Design-Expert V8.0.6軟件對熱水法提取斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白進行優(yōu)化，以膠原蛋白最大得率為目標(biāo)，得出最優(yōu)提取條件：提取溫度為94.34 ℃，提取pH為6.16，料液比為1∶10，膠原蛋白得率最大值為17.59%。根據(jù)實際生產(chǎn)將最優(yōu)提取條件調(diào)整為：提取溫度為100 ℃，提取pH為6，料液比為1∶10，進行多次驗證試驗得到膠原蛋白得率均值為16.98%，相差為0.61%，表明Box-Behnken模型可用于熱水法提取斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的工藝優(yōu)化。

3 小結(jié)

利用Box-Behnken模型對熱水法提取斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白的提取條件進行優(yōu)化，方差分析結(jié)果表明模型擬合度良好。最優(yōu)的提取條件為提取溫度100 ℃，提取pH 6，料液比1∶10，通過提取條件優(yōu)化，膠原蛋白得率提高到16.98%。結(jié)果表明，通過對提取溫度、提取pH和料液比的響應(yīng)面優(yōu)化是成功有效的，對規(guī)模化提取膠原蛋白具有參考價值。

熱水提取工藝的成本較其他方法低且簡單，所獲附加值高。本試驗為規(guī)?；崛∧z原蛋白提供了理論依據(jù)，但膠原蛋白的提取率還需要進一步優(yōu)化，可與酸法提取和酶法提取稍作整合使效率最高化。

參考文獻：

[1] NAGAI T，SUZUKI N. Isolation of collagen from fish waste material—skin，bone and fin[J]. Food Chemistry，2000，68（3）：277-281.

[2] DUAN R，ZHANG J J，DU X Q，et al. Properties of collagen from skin，scale and bone of carp（Cyprinus carpio）[J]. Food Chemistry，2009，112（3）：702-706.

[3] 連喜軍，魯曉翔，劉勤生.魚類膠原蛋白研究進展[J].肉類研究，2007（1）：46-49.

[4] 傅燕鳳，沈月新，楊承剛，等.淡水魚魚皮膠原蛋白的提取[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報，2004，13（2）：146-150.

[5] 劉朝霞，陳海光，黃東雨.魚皮膠原蛋白的提取及其應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（20）：100-102.

[6] 馬 儷，王曉丹，程 賀，等.響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取鱈魚皮中膠原蛋白條件[J].中國釀造，2010（9）：83-85.

[7] 陳麗麗，趙 利，劉 華，等.有機酸提取鲴魚皮膠原蛋白的工藝研究[J].食品與機械，2010，26（5）：118-121.

[8] 林家福，謝福美，易美華，等.熱水提取羅非魚魚皮膠原蛋白的研究[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（8）：1317-1319.

[9] 劉麗娜，付湘晉，許時嬰.斑點叉尾鮰魚皮明膠的風(fēng)味成分及其脫腥的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（12）：94-98.

[10] 夏宗祥.中國斑點叉尾鮰引進及其出口貿(mào)易淺析[J].對外經(jīng)濟貿(mào)易，2009（2）：52-54.

[11] 劉海英.斑點叉尾鮰魚皮膠原蛋白及膠原蛋白多肽的研究[D].江蘇無錫：江南大學(xué)，2007.

[12] 顧陽娟，李 杰，李富威，等.魚鱗凍水法制備工藝及性質(zhì)的研究[J].食品工業(yè)科技，2013（8）：312-345.

[13] DONG C H， XIE X Q， WANG X L， et al. Application of Box-Behnken design in optimisation for polysaccharides extraction from cultured mycelium of Cordyceps sinensis[J]. Food and Bioproducts Processing，2009，87（2）：139-144.

[14] 日本食品工業(yè)學(xué)會食品分析法編輯委員會.食品分析方法（下）[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社.1986.

[15] 李 丁，劉海英，過世東. 斑點叉尾鮰魚皮明膠制備工藝的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科枝，2006（12）：134-140.

[16] 郭恒斌，曾慶祝.魚皮膠原蛋白及膠原活性多肽的研究進展[J].食品與藥品，2007，9（8）：43-46.