摘要：研究了培養(yǎng)基保存溫度對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精的影響。結(jié)果表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基中激素不同添加時(shí)間對(duì)牛卵母細(xì)胞體外成熟率、牛體外受精胚胎卵裂率及囊胚率差異不顯著（P>0.05）；提前添加激素在4 ℃不能長期保存，而在-20 ℃能長期冷凍保存，并不會(huì)對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精胚胎的發(fā)育產(chǎn)生太大的影響。

關(guān)鍵詞：培養(yǎng)基，保存溫度；牛；卵母細(xì)胞；體外受精

中圖分類號(hào)：S823 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0137-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.036

牛體外受精技術(shù)（In vitrofertilization，IVF）一直是研究的熱點(diǎn)。近年來，隨著養(yǎng)牛業(yè)的發(fā)展，牛體外受精技術(shù)已日趨成熟。但由于體外受精技術(shù)操作環(huán)節(jié)復(fù)雜，操作過程涉及因素較多，以及卵母細(xì)胞、受精卵和早期胚胎對(duì)體外生存環(huán)境要求較高，使得試驗(yàn)體系不穩(wěn)定，可重復(fù)性差，進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性[1]。

目前牛胚胎的體外生產(chǎn)技術(shù)已得到很大提高，但是還存在著生產(chǎn)效率較低、培養(yǎng)體系不穩(wěn)定等問題。筆者主要從培養(yǎng)基的不同保存溫度方面探討了培養(yǎng)基的保存條件對(duì)黃牛卵母細(xì)胞體外成熟及其體外受精的影響，旨在進(jìn)一步尋求更為理想的培養(yǎng)基保存條件，從而為進(jìn)一步提高動(dòng)物胚胎體外生產(chǎn)的效率提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的卵巢來自于武漢市牛屠宰點(diǎn)；冷凍精子來自于武漢市奶牛改良站。

1.2 試劑

成熟培養(yǎng)液（mTCM-199）：基礎(chǔ)培養(yǎng)基TCM-199（Gibco）+10% FBS+10 IU/mL人絨毛膜促性腺激素（HMG）+雌二醇（E2）+100 IU/mL雙抗。體外受精液：BO液，體外受精獲能液：BO液+5 mmol/L咖啡因+10 mg/mL肝素鈉+3 mg/mLBSA[2]。受精卵培養(yǎng)液：CRLaa。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 卵母細(xì)胞采集及培養(yǎng) 母牛被屠宰剖腹后，立即無菌摘取卵巢，放入添加雙抗的25～35 ℃滅菌生理鹽水中4 h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室。卵巢組織用滅菌且預(yù)熱的生理鹽水清洗3次，用10 mL無菌注射器（內(nèi)有少量平衡后的DPBS）抽取卵巢表面直徑為2～8 mm的卵泡，抽取液注入15mL尖底離心管中，置于30 ℃的水浴鍋中。待COCS沉淀后，棄上清。將檢出的COCS用含體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清（FBS）的DPBS和成熟培養(yǎng)液各洗滌3次，移入含有成熟培養(yǎng)液滴的直徑為35 mm培養(yǎng)皿中。每個(gè)液滴100 μL并覆蓋石蠟油，每滴放COCs10～15枚。液滴預(yù)先在二氧化碳培養(yǎng)箱中平衡2 h以上。成熟培養(yǎng)條件39 ℃，5% CO2，相對(duì)飽和濕度。

1.3.2 體外受精

1）精子的處理。從液氮罐取細(xì)管凍精2支放入37 ℃水浴中30～40 s快速解凍，用75%乙醇消毒后剪開細(xì)管，將精子放入含有1 mL BO液的離心管中，二氧化碳培養(yǎng)箱中傾斜靜置1 h，使精子上浮，上浮后將上浮的精子用BO液1 500 r/min，5 min離心洗滌2次。

2）精子獲能處理。將離心洗滌的精子進(jìn)行獲能15 min。

3）卵子的體外受精。將體外成熟培養(yǎng)22～24 h的卵母細(xì)胞，用0.25%的胰酶進(jìn)行消化處理后，撿取有第一極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行受精。成熟卵子放入3×105個(gè)/mL獲能精子濃度的體外受精懸浮液滴，在與成熟培養(yǎng)液條件相同的條件下培養(yǎng)5 h，然后用受精卵培養(yǎng)液CRlaa（10～15枚/50 μL）進(jìn)行體外培養(yǎng)[3]。

1.4 受精卵的體外培養(yǎng)

受精后的牛卵母細(xì)胞用已平衡好的受精卵培養(yǎng)液洗滌3～5次后，轉(zhuǎn)入50 μL受精卵體外培養(yǎng)微滴中，每滴10～15枚，在39℃、5% CO2、相對(duì)飽和濕度條件下培養(yǎng)48 h。受精后48 h觀察統(tǒng)計(jì)受精率和卵裂率。每隔24 h半量更換培養(yǎng)液，觀察受精卵發(fā)育情況。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

①基礎(chǔ)培養(yǎng)基中激素不同添加時(shí)間（平衡時(shí)添加、提前添加后放4 ℃冰箱保存）對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精的影響；②成熟培養(yǎng)基mTCM-199不同保存溫度（4 ℃、-20 ℃）對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中激素添加時(shí)間對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精的影響

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中激素添加時(shí)間對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精的影響見表1，結(jié)果表明，兩種添加方法（即在平衡培養(yǎng)基時(shí)添加激素與平衡前添加激素后放冰箱）對(duì)成熟率、卵裂率及囊胚率差異不顯著（P﹥0.05）。

2.2 成熟培養(yǎng)基mTCM-199在4 ℃時(shí)保存時(shí)間對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精的影響

由表2可知，成熟培養(yǎng)基mTCM-199在4 ℃時(shí)保存1周和2周對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟率、卵裂率及囊胚率的影響不顯著（P﹥0.05）。但是隨著保存時(shí)間的延長，保存4、8周時(shí)對(duì)細(xì)胞體外成熟率、卵裂率及囊胚率均有顯著的影響，保存8周時(shí)胚胎發(fā)育停止，無囊胚的形成，囊胚率為0%。

2.3 成熟培養(yǎng)基mTCM-199在-20 ℃時(shí)保存時(shí)間對(duì)牛卵母細(xì)胞體外受精的影響

由表3可知，激素添加后放-20 ℃冰箱，保存時(shí)間1、2、4、8周時(shí)對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟率和卵裂率的影響不顯著（P﹥0.05），但是隨著時(shí)間的延長，囊胚率明顯降低。

3 討論

體外受精技術(shù)是繼人工授精、胚胎移植技術(shù)之后，家畜繁殖領(lǐng)域的第三次革命，是生物工程的研究內(nèi)容之一，它建立在受精生物學(xué)、早期胚胎發(fā)育機(jī)制等理論研究成果的基礎(chǔ)上。由卵母細(xì)胞的體外成熟、精子的體外獲能、卵母細(xì)胞的體外受精、受精卵的體外發(fā)育、配子和胚胎的冷凍保存及胚胎移植等程序組成的完整系統(tǒng)。

隨著胚胎工程技術(shù)的深入研究和商業(yè)化的推廣應(yīng)用，對(duì)有效胚胎的需求量日益增加，僅靠體內(nèi)生產(chǎn)牛胚胎遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足動(dòng)物生產(chǎn)和科學(xué)研究的需要，因而，如何最大程度地提高胚胎的體外生產(chǎn)效率成為亟待解決的問題，體外受精技術(shù)為胚胎來源開辟了一個(gè)新途徑[4，5]。體外受精技術(shù)可利用屠宰場的卵巢生產(chǎn)大量、價(jià)廉、質(zhì)優(yōu)的胚胎，解決胚胎來源問題。體外受精技術(shù)包括卵母細(xì)胞的體外成熟、精子獲能、體外受精和早期胚胎的體外培養(yǎng)等環(huán)節(jié)，其中卵母細(xì)胞的體外成熟是最為關(guān)鍵的一步，牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響因素很多，成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)基尤為重要，

在體外受精研究中卵母細(xì)胞成熟的基礎(chǔ)培養(yǎng)液一般選用TCM-199，CRlaa，NUSC23和MEM等，其中在牛體外受精中應(yīng)用最廣泛的是TCM-199。由于TCM-199的核苷、黃嘌呤和次黃嘌呤對(duì)卵母細(xì)胞核成熟有抑制作用的成分濃度相對(duì)較低，故其成熟培養(yǎng)的效果相對(duì)較好，牛、羊、豬等卵母細(xì)胞的核成熟率都在80%左右[6]，并且大量的實(shí)驗(yàn)研究證明，成熟培養(yǎng)液還需要在上述培養(yǎng)液中加入血清FCS、NCS或ECS（5%～10%）以及促性腺激素LH和FSH（0.1 μg/mL）等[7，8]，然而，TCM-199的成分比較復(fù)雜，通常情況下都保存在4 ℃以確保其中的成分不發(fā)生化學(xué)變化而影響培養(yǎng)效果，筆者在偶然的情況下，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過-20 ℃短期冷凍，并不會(huì)很大程度由于影響卵母細(xì)胞的成熟及其后期胚胎發(fā)育，因此，筆者又進(jìn)行了多次試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在黃牛卵母細(xì)胞體外成熟基礎(chǔ)培養(yǎng)液TCM-199-20 ℃短期冷凍，并不會(huì)對(duì)黃牛卵母細(xì)胞體外受精胚胎的發(fā)育產(chǎn)生太大的影響，這樣在一定程度上減少了培養(yǎng)基等試劑的浪費(fèi)，并且更不容易污染，但是對(duì)胚胎進(jìn)行冷凍或者移植是否有影響有待進(jìn)一步的研究。

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