摘要：對云南省蒙自市6個主要棗樹栽培品種儲藏期的腐爛果實表面的病原真菌進行分離和鑒定，得到25株優(yōu)勢病原真菌，分別擴增得到核糖體DNA轉錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）序列，通過對ITS的生物信息學和系統(tǒng)發(fā)育分析，并結合菌落形態(tài)特征，鑒定病原真菌分別為鏈格孢屬（Alternaria sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）、葡萄座腔菌屬（Neofusicoccum sp.）和脈紋孢菌屬（Neurospora sp.）。

關鍵詞： 棗果； 采后病害； 病原真菌； rDNA-ITS； 生物信息學； 序列分析

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）01-0070-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.020

鼠李科（Rhamnaceae）植物棗（Zizyphus jujube Mill）是中國的原產(chǎn)果樹之一，已有數(shù)千年的栽培歷史[1]。棗樹在中國分布面廣、適應性強、品種多、風味好，深受廣大群眾的喜愛，已成為中國果樹發(fā)展的新熱點[2]。蒙自小棗是云南蒙自較為古老的地方品種，早在明末清初已有栽培記載[3]。蒙自小棗果實近圓形，平均單果重7 g。近年來，蒙自小棗以其外觀亮、皮薄、肉厚且細膩、味特甜、口感好、品質佳、早熟（較國內(nèi)其他棗種早熟半個月以上）等優(yōu)勢熱銷省內(nèi)外[4]，是蒙自三大果林經(jīng)濟作物（小棗、大枇杷、甜石榴）中單位面積產(chǎn)值最高者。

棗果的自然保鮮能力較差，在貯藏中果實極易感染微生物而引起腐爛變質失去商品價值，嚴重制約了中國紅棗產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。棗果采后病害可分為2種類型，一類是由于生理活動受到不適宜的外界條件干擾而造成的生理病害；另一類是由病原微生物引起的病理病害（侵染性病害）。據(jù)國內(nèi)外文獻報道，病原微生物可侵染棗葉片和棗果，棗葉片上的主要病害有棗瘋病[5，6]、棗銹病[7]和棗葉斑病[8]等；棗果實主要病害有棗輪紋病[9]、棗縮果病[10]、棗黑腐病[11]、棗炭疽病[12]等。其中棗瘋病、棗銹病和棗縮果病被稱為棗樹的三大病害。在果實儲藏期，鏈格孢霉（Alternaria tenuis）、莖點霉（Phomaglomerata）等可引起棗果斑點性病害；鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、黑附球菌（Epicoccum nigrum）可引起棗果實腐爛。因此對采摘后的棗果致病真菌進行分離和鑒定可以為科學用藥提供有效的指導。

傳統(tǒng)致病菌的鑒定主要通過形態(tài)學特征進行，受很多因素的限制。隨著分子生物學技術的發(fā)展，18S rDNA基因序列在真菌的分類和鑒定系統(tǒng)中的應用越來越廣泛[13，14]。保守的18S和28S序列有利于屬的鑒定，核糖體DNA轉錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）則多運用于種的鑒定。對ITS序列進行生物信息學和系統(tǒng)發(fā)育分析，可以快速闡明菌株之間的進化關系和種群間的親緣關系[15]。以上方法可以為快速和準確的鑒定植物真菌病害提供一定基礎。

本研究以云南蒙自地區(qū)的冰糖棗、蒙自小棗、特早金脆蜜棗、胎里紅棗、中華梨棗和早甜蜜甲棗等6個品種為主要研究對象，分離和純化引起貯藏期的主要致病真菌，在傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的基礎上，對貯藏期腐爛棗中分離到的菌株進行rDNA-ITS序列分析和分子鑒定，為不同品種棗貯藏期真菌病害防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

從云南省蒙自市文瀾鎮(zhèn)白路腳村蒙鑫大棚棗園基地采得冰糖棗、特早金脆蜜棗、胎里紅棗、中華梨棗和早甜蜜甲棗5個品種的棗果，從云南省蒙自市紅寨鄉(xiāng)高家寨小棗種植園采得蒙自小棗。共采集棗果樣品64份，其中高家寨棗園12份，蒙鑫大棚棗園52份，放入果品專用保鮮袋，4 ℃保存。

1.2 生化試劑

離心柱型基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）；1×TAE Buffer（0.04 mol/L Tris-Cl，0.001 mol/L EDTA，pH8.0），瓊脂糖（AR），0.5 mg/mL EB，DL5 000 DNA Marker，λ-Hind Ⅲdigest DNA Marker（寶生物工程（大連）有限公司）；2×Taq PCR Master Mix（北京東盛創(chuàng)新生物科技有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：取馬鈴薯200 g去皮切碎，加入800 mL去離子水，煮沸30 min，冷卻后雙層紗布過濾，取濾液，加葡萄糖20 g，定容至1 L，高壓蒸汽115 ℃滅菌20 min，備用。

PDA固體培養(yǎng)基：在PDA培養(yǎng)基的基礎上，加入1.5%～2%的瓊脂粉。

1.4 病原菌分離純化與菌株命名

組織分離法：用滅菌刀片分離病健處約5 mm2的果實組織塊，浸泡于體積分數(shù)為75%的乙醇中30 s，然后用NaClO溶液處理1～3 min，去離子水沖洗3次，移入PDA平板上倒置于霉菌培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)3 d后觀察菌落生長狀況。

劃線分離法：將分離獲得的真菌菌落培養(yǎng)產(chǎn)生孢子，用接種針挑取不同形態(tài)的病原真菌的孢子或菌絲，在PDA平板上劃線，培養(yǎng)條件同上。重復劃線分離3～4次后即可純化不同的單菌落菌株。不易純化的菌株采取稀釋平板法獲得單孢純化。

純化所得菌種分別照樣品品種名稱前兩個漢字的拼音首字母大寫組合及菌株分離順序依次編號命名，如冰糖棗中分離到的第4株菌命名為BT4。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 單菌落培養(yǎng)與形態(tài)觀察

點植法：菌落疏松易于挑取菌絲的菌株，用接種針挑起菌落邊緣的少許菌絲，點植于平板PDA中央，進行平板封口后倒置于霉菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5～7 d，即可得到均勻單一的菌落。

移植法：菌落致密緊貼平板的菌株直接用打孔器從已純化菌落上取適宜大小的菌餅接種；孢子較多的菌株用去離子水稀釋的孢子懸浮液接種，置于霉菌培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)5～7 d，即可得到均勻單一菌落。

形態(tài)學觀察：培養(yǎng)5～7 d后，先觀察單菌落的形態(tài)特征，后進行菌落插片培養(yǎng)，以去離子水為負載劑制片后，熒光顯微鏡下觀察各菌株細胞形態(tài)特征。

1.6 基因組DNA的提取

28 ℃條件下，搖瓶培養(yǎng)各菌株收集菌絲體，去離子水沖洗培養(yǎng)基及雜質，濾紙吸干水分，液氮充分研磨菌絲體至粉末，裝入1.5 mL離心管中，用真菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA[16]，具體步驟參照試劑盒使用說明書，后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取基因組DNA的完整性。

1.7 基于真菌rDNA-ITS序列的分子鑒定

rDNA-ITS序列的擴增參照White等[17]的方法。以基因組DNA為模板，運用通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）（南京金斯瑞生物科技有限公司）擴增致病真菌的ITS基因。

PCR擴增體系：模板DNA（0.5 μg/μL）3.0 μL，2×PCRmix（廣東東勝生物科技有限公司）12.5 μL，ITS1、ITS4引物（10.0 μmol/L）各2.0 μL，加ddH2O至25.0 μL。

PCR擴增程序：94 ℃，預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.8 序列比對及分子系統(tǒng)發(fā)育樹構建

檢測純化回收PCR產(chǎn)物并由南京金斯瑞生物科技有限公司測序，采用ClustalW 2.0軟件比對ITS基因序列，設置空位罰分為10、BLOSUM權重矩陣[18]。將各菌株ITS序列結果登陸到GenBank數(shù)據(jù)庫，通過BLAST程序搜索數(shù)據(jù)庫中相關高度相似序列。通過CLUSTAL_X和Mega 4.1軟件采用Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)進化發(fā)育樹，并計算Bootstrap值，分析菌株之間在進化上的親緣關系[19]。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離純化

分別用PDA培養(yǎng)基分離純化獲得16個株菌，接種于PDA平板中央置于霉菌培養(yǎng)箱中28 ℃進行培養(yǎng)；其中，菌絲生長較快的菌株培養(yǎng)3 d，菌絲生長速度中等的菌株培養(yǎng)5～7 d，而產(chǎn)孢子且生長慢的菌株培養(yǎng)9 d，多數(shù)菌落的顏色、大小、形狀、菌絲或孢子等差異較為明顯，其中BT（冰糖棗）、ZH（中華梨棗）、ZT（早甜蜜甲棗）這3個品種的棗果上分離出來的4號、38號、41號、43號以及49號病原真菌培養(yǎng)于PDA平板上28 ℃可以產(chǎn)生孢子。各樣品分離純化的菌株的編號、培養(yǎng)周期及其產(chǎn)孢結果見表1。

2.2 菌株的形態(tài)學觀察

所分離的16個菌株在28 ℃條件下PDA培養(yǎng)基上進行單菌落培養(yǎng)，根據(jù)其生長速度快慢分別培養(yǎng)3、5～7 d和9 d后觀察菌落形態(tài)；其間，于單菌落長出后在其邊緣進行插片，菌絲爬片或產(chǎn)孢后進行鏡檢。菌落形態(tài)觀察包括菌落正反面顏色、菌落邊緣形狀、菌落表面布紋、菌落高度、菌落大小、菌落質地以及菌絲長短、粗細、有無橫膈及核、分枝、分生孢子梗、分生孢子形態(tài)和產(chǎn)孢結構等[20，21]（圖1）。所分離菌株的單菌落形態(tài)、菌絲和孢子的顯微特征（圖2），各菌株的菌落形態(tài)、菌絲和孢子的顯微特征描述見表2。

2.3 致病菌株基因組DNA和ITS基因序列分析

本試驗獲得的致病霉菌基因組DNA片段經(jīng)DNA電泳檢測，結果顯示，多數(shù)菌株基因組DNA分子量大約為10～20 kb（圖3A），多數(shù)菌株ITS基因大小在500～750 bp之間（圖3B），而菌株TJ29、TL35、TL36和ZT46的ITS基因大小在250～500 bp之間，菌株ZH38、ZT45和ZT49的ITS基因大小在750～ 1 000 bp之間。測序結果顯示各菌株ITS基因長度為316～928 bp，約56%的菌株ITS序列長度在500～750 bp之間，25%的菌株ITS序列長度在250～500 bp之間，約19%的菌株ITS序列長度在750～1 000 bp之間，與電泳檢測結果基本一致，所有菌株的ITS序列平均長度約為568 bp，各菌株的ITS序列長度統(tǒng)計見表3。

2.4 菌株的分子鑒定結果與ITS序列系統(tǒng)進化分析

根據(jù)BLAST比對結果，結合菌株的形態(tài)學特征，利用生物學軟件MEGA4.0構建系統(tǒng)發(fā)育樹。鑒定結果表明，ZH43和ZT49屬于曲霉屬；ZH38位于曲霉屬菌株鄰近的單獨分枝上，分枝結點的支持系數(shù)為100，親緣關系較近，認為其可能為曲霉屬的潛在新種或變種（圖4）。BT4、MZ12、TJ29、TL37、ZH41、ZT44、ZT45鏈格孢屬；TJ26、TJ27位于鏈格孢屬菌株鄰近的單獨分枝的兩個側枝上，其分枝結點為63，認為其可能為鏈格孢屬的兩個不同的潛在新種或變種（圖5）。TL35、TL36和ZT50屬于葡萄座腔菌屬；ZT46屬于脈紋孢菌屬（圖6）。

3 小結與討論

棗果儲存期病原真菌的傳統(tǒng)鑒定一般根據(jù)分生孢子形態(tài)、大小、分生孢子梗及菌落形態(tài)等形態(tài)學特征，結合其生理生化性狀作相關的描述。但是，有一些霉菌的形態(tài)學特征又因環(huán)境的差異而變化，不少霉菌培養(yǎng)性狀的可變性及形態(tài)特征的交叉，必然導致霉菌的分類標準不可靠。故采用傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定霉菌會產(chǎn)生一定的分歧，存在著一定的弊端。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，ITS分子標記已被廣泛應用于霉菌的屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究，為真菌的系統(tǒng)發(fā)育和分類鑒定提供豐富的遺傳信息。本研究中，在菌種保存過程中發(fā)現(xiàn)，繼代會造成菌株形態(tài)上不同程度的不穩(wěn)定性，以TJ29、ZH38和ZT45最為明顯；并且在菌株培養(yǎng)和菌種保存過程中，多數(shù)菌株不產(chǎn)孢，依靠序列分析對16個菌株進行了鑒定、分類，提高了鑒定的可靠性和準確性。

國內(nèi)鄭曉蓮等[22]、徐祥彬等[23]、李冬霞[24]研究認為，鏈格孢菌、橄欖色盾殼霉菌（Coniaothyrium olivaceum Bon）、聚生小穴殼菌（Dothriorella gregaria Sacc）、青霉菌（Penicillium expansum）、芽枝孢菌（Cladosporium tenuissimum）、七葉樹殼梭孢（Fusicoccum aesculi Corda）和莖點霉菌（Phoma sp.）是棗縮果病的病原真菌；王軍等[25]、李夏鳴等[26]研究認為，引起棗果黑斑的病原為鏈格孢菌；劉春琴等[27]人研究認為，囊孢殼菌（Physalosoora obtuse）、莖點霉菌和細鏈格孢菌是金絲小棗漿爛果病的致病菌。據(jù)國外文獻報道，在果實儲藏期，鏈格孢屬、莖點菌、玉米新月彎孢霉（Curvularia lunat）、多主枝孢霉（Cladosporium herbarum）可引起棗果斑點性病害；鐮刀菌、黑附球菌可引起棗果實腐爛[28]。本研究結果顯示鏈格孢屬9株，為優(yōu)勢菌群，與上述報道一致。3株為葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria），該病原菌趙曉軍等[29]認為是棗樹干腐病病原菌的致病真菌的無性階段。而本研究鑒定分離出來的曲霉屬及脈紋孢菌屬在國內(nèi)未見報道，另一棗果病原優(yōu)勢真菌群莖點霉菌在本研究中未發(fā)現(xiàn)。這可能是由于真菌鑒定時采用的方法不同所致，也可能與采樣在不同的年份、不同的栽培地、病蟲害防治和管理手段的差異等有關，其不同的生態(tài)環(huán)境造成棗果表面分布不同的霉菌。本研究的樣品材料來自蒙自地區(qū)兩個規(guī)模較大的棗果生產(chǎn)基地，取材范圍較為狹窄，還應擴大篩選范圍，同時進行多年取樣研究，從而進一步驗證以上結論。此外，本研究中所分離的引起棗果腐爛的霉菌來自兩組樣標，一組為采集時已腐爛的棗果，另一組為健康棗果，后者采樣后于4 ℃冰箱中貯存腐爛后無菌條件下進行組織分離菌種，根據(jù)分離純化結果初步確定這些菌株與棗果的腐爛有關，而進一步確認其是否均為棗果腐爛的直接病原菌，還需于次年采集相應品種的健康棗果做回接試驗進行后續(xù)研究進一步確定。

本研究從云南蒙自地區(qū)的6個不同品種的棗果中分離得到16株致病霉菌，經(jīng)形態(tài)學特征觀察和ITS序列分析鑒定其隸屬鏈格孢屬、曲霉屬、葡萄座腔菌屬和脈紋孢菌屬4個菌屬；其中鏈格孢屬9株，曲霉屬3株，葡萄座腔菌屬3株，脈紋孢菌屬1株。采用ITS序列分析結合形態(tài)學特征觀察可準確、快速鑒定引起棗果腐爛的病原真菌，且結果可靠，可為棗果采收期或貯藏期腐爛霉菌的綜合防治研究提供一定的理論支持，同時還可為引起其他果蔬采收期或貯藏期的真菌性病原菌鑒定提供一定的參考。

從國內(nèi)外的研究報道可知，由病原微生物引起的棗果實病害棗縮果病和棗黑斑病的主要病原真菌為鏈格孢屬病原菌，該病原菌屬于半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目黑色菌科，是農(nóng)作物的主要致病菌之一。全世界已報道的近500個鏈格孢屬病原真菌95%以上可兼性寄生于植物引起作物病害[30]，其代謝產(chǎn)物可導致受害植物產(chǎn)生諸如黑斑病、褐斑病、莖枯病等癥狀，對作物的產(chǎn)量和品質產(chǎn)生嚴重影響，從而造成巨大的經(jīng)濟損失。化學防治是防治由鏈格孢屬真菌引起的農(nóng)作物疫病的有效手段[31]。目前防治這些疫病的化學藥劑主要有代森錳鋅、異菌脲、三唑酮、嘧菌酯、腐霉利等[32]。但是由于這些藥劑的長期使用使得部分地區(qū)的鏈格孢屬真菌已經(jīng)對一些殺菌劑產(chǎn)生了一定的抗藥性。目前國內(nèi)外對鏈格孢屬的抗藥性的報道主要集中在農(nóng)作物上，引起棗縮果病和棗黑斑病的鏈格孢屬真菌的抗藥性篩選及作用機理在國內(nèi)外還鮮有報道。

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