摘要：為了改良優(yōu)良水稻（Oryza.sativa L.）恢復(fù)系對(duì)稻瘟病的抗性，以含廣譜抗稻瘟病基因Pi9的C12為供體，襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主選育的雜交稻父本R997為受體，通過雜交、回交和自交并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇（MAS），將Pi9基因?qū)氲絉997中，經(jīng)大田篩選出綜合性狀較好的恢復(fù)系單株123個(gè)。經(jīng)過苗瘟和穗頸瘟人工接種鑒定，最后選擇攜帶Pi9抗病基因且大田抗性表現(xiàn)較好的13個(gè)改良新材料用于進(jìn)一步的雜交組合測(cè)配，以期選育出綜合抗性強(qiáng)的新品種。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza.sativa L.）；稻瘟病抗性；分子標(biāo)記輔助選擇

中圖分類號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）01-0020-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.01.006

稻瘟病菌（Magnaporthegrisea）引起的稻瘟病害是湖北西南地區(qū)最具毀滅性的病害之一，目前控制稻瘟病既環(huán)保又經(jīng)濟(jì)有效的措施是培育和種植抗稻瘟病品種。在水稻（Oryza.sativa L.）抗稻瘟病育種中，傳統(tǒng)的水稻抗病育種依賴于抗性鑒定和植株表型的選擇，要求豐富的經(jīng)驗(yàn)和較長(zhǎng)的育種年限，并且受有無合適的病菌菌株和病菌發(fā)病條件的限制，鑒定結(jié)果容易造成誤差，甚至造成抗性基因的丟失，選擇效率較低。分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）不受環(huán)境條件的限制，不受其他基因效應(yīng)的影響，選擇準(zhǔn)確性好，育種效率高，是今后育種發(fā)展的主要方向之一。與此同時(shí)，配合完善的人工接種病菌鑒定，通過鑒定與評(píng)價(jià)水稻品種對(duì)稻瘟病菌的抗性，在生產(chǎn)上合理布局抗病品種，對(duì)稻瘟病的防治具有重要的意義。

目前，已有近百個(gè)稻瘟病抗性基因被鑒定，其中，Pib、Pita、Pi9、Pi1、Pi2、Piz-t、Pi36和Pi37等基因已被分離克隆，來自小粒野生稻（Oryza minuta）的Pi9基因?qū)Φ疚敛【哂袕V譜和持久性抗性，有著廣闊的應(yīng)用前景[1-7]。試驗(yàn)以湖北省襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主選育的粵優(yōu)997的恢復(fù)系R997為改良親本，利用MAS方法進(jìn)行稻瘟病抗性改良，以期獲得綜合性狀好，對(duì)稻瘟病有良好抗性的水稻新品種。

1 材料與方法

1.1 供試水稻品種及接種菌株來源

供試水稻品種： R997（襄陽市農(nóng)業(yè)科學(xué)院自育雜交稻恢復(fù)系）；攜帶有Pi9抗稻瘟病基因的供體親本C12（由常規(guī)栽培稻和小粒野生稻雜交選育后代，高抗稻瘟病，引物PB8檢測(cè)呈陽性）。接種菌株來源：黃岡市農(nóng)業(yè)科學(xué)院呂瑞玲博士提供的稻瘟病混合孢子懸浮液。

1.2 分子標(biāo)記輔助選擇體系的建立

1.2.1 將目標(biāo)基因從供體親本轉(zhuǎn)移到輪回親本 以含有廣譜稻瘟病抗性基因Pi9的C12為供體，目前應(yīng)用較廣的恢復(fù)系R997為受體，通過回交程序并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將Pi9基因?qū)氲絉997中，獲得若干個(gè)攜帶有抗稻瘟病基因Pi9的背景回復(fù)率較高且田間抗性較好的優(yōu)良水稻恢復(fù)系。

1.2.2 抗性基因連鎖標(biāo)記 選擇理想的分子標(biāo)記是進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種的前提條件。Liu等[4]開發(fā)的與Pi9緊密連鎖的SCAR標(biāo)記PB8（離Pi9基因0.08 cM）被倪大虎等[5-7]成功應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種中，經(jīng)田間抗性驗(yàn)證，準(zhǔn)確率較高，完全可以勝任分子育種實(shí)踐。本試驗(yàn)兩親本R997和C12在該標(biāo)記處有顯著的多態(tài)性，因此檢測(cè)Pi9抗性基因使用的是SCAR標(biāo)記PB8。PB8的引物序列為F：CCGGACTAAGTACTGGCTTCGATA；R：CCCAATCTC

CAATGACCCATAAC[8]。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.3 SSR分子標(biāo)記檢測(cè)

1.3.1 水稻基因組DNA提取 采用CTAB法，并稍作改動(dòng)。取水稻嫩葉2 cm左右，加入750 μL CTAB提取液研磨成漿狀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中于65 ℃水浴4 min，再加入750 μL三氯甲烷與異戊醇體積比為24∶1的混合溶液，振蕩15 min，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管，加750 μL 95%冰凍乙醇，輕搖2 min，然后放入 -20 ℃冰箱中冷凍數(shù)小時(shí)后以10 000 r/min離心10 min，棄上清液，倒置于吸水紙上晾干，最后加去離子水溶解備用。

1.3.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)已發(fā)表的遺傳連鎖圖譜和Gramene數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.gramene.orsdb/cmap），選擇均勻分布于水稻12條染色體上的簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）進(jìn)行R997和C12之間的多態(tài)性檢測(cè)，用于選擇背景回復(fù)率高的抗稻瘟病后代材料。SSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，31個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min；12 ℃保溫。SSR引物退火溫度參照（http：//www.gramene.org/microsat/ssr.html）網(wǎng)站推薦的退火溫度，根據(jù)個(gè)別引物有少許改動(dòng)。

1.3.3 聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物通過8.0%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。主要程序如下：①將玻璃長(zhǎng)板、短板、夾條、梳子、橡皮墊圈等部件用去污劑沖洗干凈，并用95%乙醇沿一個(gè)方向擦拭，風(fēng)干，然后將橡皮墊圈套到長(zhǎng)板上，水平放置于操作臺(tái)，將夾條整齊地放于長(zhǎng)板兩邊，最后將短板對(duì)應(yīng)地放在長(zhǎng)板上面，將兩側(cè)用夾子對(duì)稱夾好，水平放置于操作臺(tái)上；②將配制好的35 mL左右的8.0%聚丙烯酰胺溶液混勻后灌入玻璃長(zhǎng)短板間直至液面達(dá)到短板頂端，將梳子的平端插入0.5 cm，靜置30 min使膠液完全凝固；③在電泳槽下槽加入約 220 mL 1×TAE緩沖液，除去電泳槽底部氣泡；④除去玻璃板上的夾子和橡皮墊圈，將灌膠后的玻璃板分別放到電泳槽內(nèi)外兩側(cè)，短板沖里，用夾子將玻璃板固定；⑤在電泳槽上槽加滿1×TAE，抓住梳子兩端緩慢拔出；⑥往每管PCR產(chǎn)物（10 μL）中加入2 μL考馬斯亮藍(lán)緩沖液，離心后，每管吸取2 μL依次加入點(diǎn)樣孔，每點(diǎn)一次樣清洗一下槍頭；⑦蓋上電泳蓋，調(diào)電壓至100 V，定時(shí)，接通電極進(jìn)行電泳（電泳時(shí)間可以根據(jù)PCR片段大小適當(dāng)調(diào)整）；⑧取下蓋子，除去夾子，輕輕撬開玻璃板，將凝膠置于染液槽（150 μL 1×TAE 緩沖液+15 μL核酸染料），50 r/min 振蕩遮光染色40 min；⑨用塑料薄板輕輕托起凝膠，置于醫(yī)用觀膠儀上觀察電泳圖譜，并記錄相關(guān)結(jié)果。

1.4 稻瘟病人工接種方法

1.4.1 苗瘟鑒定方法 水稻苗瘟抗性鑒定采用苗期噴霧法接種，具體操作如下：①將參試材料用多菌靈浸種1 d后，用清水沖洗催芽2～3 d，播于育秧盤內(nèi)，每品種（系）播20～30粒。②將供試菌株轉(zhuǎn)接到燕麥培養(yǎng)基上，在25 ℃下培養(yǎng)10 d，用黑光燈照射3 d后，待稻瘟病菌產(chǎn)生孢子后，再用無菌水刮洗，配成100倍顯微鏡視野下35～40個(gè)孢子的懸浮液，在水稻秧苗3葉1心期時(shí)隔離噴霧接種，設(shè)3個(gè)重復(fù)。③在遮陽網(wǎng)遮蓋的大棚內(nèi)，7 d后檢查發(fā)病情況，按國(guó)際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)記載，其標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：沒有癥狀，免疫；1級(jí)：很小的褐色小點(diǎn)，高抗；2級(jí)：直徑為1 mm的褐色病斑，抗?。?級(jí)：直徑為2～3 mm的帶橢圓形的病斑，中央灰色，邊緣褐色，中抗；4級(jí)： 長(zhǎng)1～2 cm的橢圓形病斑，中央灰色，邊緣褐色，感??；5級(jí)：形成長(zhǎng)而寬的大橢圓形病斑，病斑發(fā)展到后期或條件不適宜時(shí)，邊緣褐色，高感。

1.4.2 穗頸瘟鑒定方法 水稻穗頸瘟用上述稻瘟病菌株孢子的混合液在水稻孕穗初期注射接種，孢子量同苗期孢子含量，每株注射1 mL左右，在水稻成熟后按標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查結(jié)果。穗頸瘟鑒定標(biāo)準(zhǔn)如下：0級(jí)：無病，免疫；l級(jí)：1/4以下枝梗發(fā)病或穗頸有斑點(diǎn)，抗?。?級(jí)：1/4以上枝梗發(fā)病或主軸中部發(fā)病，或頸部有病，但對(duì)產(chǎn)量影響不大，中抗；3級(jí)：主軸中部或頸部發(fā)病，對(duì)產(chǎn)量有顯著影響，感??；4級(jí)：穗頸發(fā)病造成白穗，高感。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗性基因連鎖標(biāo)記檢測(cè)

應(yīng)用與抗性基因Pi9緊密連鎖的SCAR標(biāo)記PB8對(duì)所獲得的123個(gè)大田表現(xiàn)較好的回交導(dǎo)入系材料進(jìn)行分子標(biāo)記掃描，檢測(cè)到攜帶有稻瘟病抗性基因的株系32個(gè)。其親本電泳結(jié)果如圖1所示。

2.2 稻瘟病人工接菌大田抗性鑒定

通過對(duì)攜帶有Pi9基因連鎖標(biāo)記的32個(gè)株系材料進(jìn)行苗瘟鑒定和穗頸瘟鑒定，結(jié)果如表1所示。其中在苗瘟和穗頸瘟兩次鑒定中均抗病的株系材料有13個(gè)。

2.3 背景回復(fù)率掃描

對(duì)上述13個(gè)抗病株系分別用在兩個(gè)親本間有多態(tài)性且均勻覆蓋水稻12條染色體的56個(gè)SSR分子標(biāo)記進(jìn)行全基因組掃描，檢測(cè)所選后代抗稻瘟病材料的群基因組背景回復(fù)率，結(jié)果如表2所示。由表2可知，這13個(gè)攜帶有Pi9基因且大田抗性較好的單株的背景回復(fù)率介于72.78%～85.16%。綜合上述結(jié)果可知，通過MAS方法獲得的13株株系，其田間農(nóng)藝性狀較好，攜帶有Pi9基因且大田條件下對(duì)稻瘟病抗性表現(xiàn)好，達(dá)到預(yù)期效果，將這13株改良新恢復(fù)系用于進(jìn)一步的雜交組合測(cè)配，以期選育出綜合抗性強(qiáng)的新品種。

3 討論

3.1 水稻抗稻瘟病基因的選擇與利用

抗性育種的前提條件是需要一個(gè)抗性好的抗源。Liu等[4]用來自13個(gè)國(guó)家的43個(gè)稻瘟病小種對(duì)攜帶有Pi9的水稻材料進(jìn)行抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)其對(duì)所有供試小種均表現(xiàn)出很高的抗性，是一個(gè)廣譜抗稻瘟病基因。倪大虎等[5-7]將Pi9應(yīng)用于育種研究，同樣發(fā)現(xiàn)該基因?qū)Φ疚敛∮泻芎玫目剐?。本研究將含有Pi9基因的基礎(chǔ)育種材料C12以及選育出的攜帶有該基因的高代材料在苗期和孕穗初期接種稻瘟病混合孢子懸浮液，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)株系在苗瘟?xí)r檢測(cè)到高抗稻瘟病，在穗頸瘟接種時(shí)發(fā)現(xiàn)其輕微感?。挥?個(gè)株系在苗期有輕微病狀，但穗頸瘟檢測(cè)卻表現(xiàn)出很好的抗性，這可能是孢子混合液種的菌株種類較多、致病性較強(qiáng)的緣故。綜合來看，這些攜帶有Pi9基因的水稻材料大多表現(xiàn)出很好的抗性，進(jìn)一步表明Pi9基因是一個(gè)很好的抗病基因，導(dǎo)入到秈稻恢復(fù)系中能大大提高其對(duì)稻瘟病的抗性。

分子標(biāo)記輔助選擇是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物改良過程中進(jìn)行選擇的一種輔助手段。其基本原理是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記對(duì)選擇個(gè)體進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域以及全基因組篩選，從而減少連鎖累贅，獲得期望的個(gè)體，達(dá)到提高育種效率的目的。在育種中，為了改善某一品種的某一性狀，常用的方法是以優(yōu)良品種作為輪回親本，以具有目標(biāo)基因的另一品種作為供體親本，多次回交，將目標(biāo)基因從供體親本轉(zhuǎn)移到輪回親本。由于在回交過程中，隨著有利基因的導(dǎo)入，不可避免地將與之連鎖的不利基因（或染色體片段）引入，成為連鎖累贅。利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可以直接選擇在目標(biāo)基因附近發(fā)生重組的個(gè)體，從而避免或顯著減少連鎖累贅，提高育種效率。

3.2 導(dǎo)入目的基因的抗性效應(yīng)與改良的意義

在常規(guī)育種中，很多抗性改良工作多以當(dāng)?shù)刂魍破贩N作為改良親本，其改良過程大多需要5年左右的時(shí)間，在這段時(shí)間里，所改良的品種和所選用的目的基因可能已被新品種或新基因替代，所選出的改良新品種沒有明顯的優(yōu)勢(shì)和實(shí)際的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。本試驗(yàn)選用的改良親本是具有9311背景的R997，而9311背景的材料是長(zhǎng)江中下游地區(qū)極為重要的恢復(fù)系材料，應(yīng)用面積非常大。由于R997具有配合力好、制種產(chǎn)量較高、米質(zhì)較優(yōu)等特點(diǎn)，改造其很有意義。本研究以含廣譜稻瘟病抗性基因Pi9的C12為供體，優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系R997為受體，通過回交程序并結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，將Pi9基因?qū)氲絉997中，獲得了13株攜帶有Pi9抗性基因的優(yōu)良恢復(fù)系材料，這些育成的改良高代材料經(jīng)抗性鑒定，稻瘟病抗性均得到顯著提高，且其他綜合農(nóng)藝性狀跟改良親本R997相比也有所提高，達(dá)到了抗性改良導(dǎo)入抗病基因的初衷，這些改良材料可以用于進(jìn)一步的雜交組合測(cè)配，以期選育出綜合抗性強(qiáng)的新品種。綜上所述，這種育種方法既能縮短基因定位研究與育種應(yīng)用的距離，又可以減少費(fèi)用和育種年限，提高選擇效率。

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