摘要：目的 比較免疫組化PV二步法和SP三步法。方法 通過(guò)兩組不一樣的試劑盒來(lái)對(duì)一樣的胃癌常規(guī)石蠟標(biāo)本進(jìn)行研究，比較免疫組化PV二步法和SP三步法在相同組織上的不同表達(dá)。結(jié)果 與二步法相比，三步法制片結(jié)果的陽(yáng)性率和背景低，非特異性著色小，結(jié)果比較明確易讀；而與三步法相比較，二步法的操作更加簡(jiǎn)單方便，檢查陽(yáng)性率和陽(yáng)性強(qiáng)度更高。結(jié)論 面對(duì)一抗為C-MET的免疫組化染色，三步法的實(shí)驗(yàn)時(shí)間雖然更長(zhǎng)，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確易讀，對(duì)于科學(xué)研究比較適用。二步法則容易得出結(jié)果，陽(yáng)性強(qiáng)度、靈敏度和假陽(yáng)性率更高，容易出背景著色，對(duì)于科學(xué)研究不適用，但是因?yàn)槎椒ú僮鞲雍?jiǎn)單方便，陽(yáng)性檢出率更高，在診斷C-MET弱表達(dá)患者時(shí)漏診率低，得到結(jié)果的時(shí)間更短，所以適合用于臨床病理診斷。

關(guān)鍵詞：免疫組化；二步法；三步法

免疫組化技術(shù)就是通過(guò)已知的特異性抗體和抗原的特異性結(jié)合，來(lái)對(duì)細(xì)胞或者組織內(nèi)某物質(zhì)性質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)通過(guò)酶作用于底物所產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來(lái)對(duì)物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布情況進(jìn)行顯示[1]。隨著免疫酶標(biāo)技術(shù)的發(fā)展，免疫組化技術(shù)也得到了快速的發(fā)展和完善，在臨床診斷和科研中免疫組化技術(shù)的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。本研究選擇C-MET作為目的指標(biāo)，對(duì)免疫組化二步法和三步法在C-MET檢測(cè)中的差異進(jìn)行了觀察，分析了兩組方法在實(shí)際使用中的差異。

1資料與方法

1.1一般資料 選擇胃癌常規(guī)石蠟標(biāo)本。選擇C-MET兔抗人多克隆抗體，胞漿著色表示陽(yáng)性。二步法PV-9000試劑盒和三步法SP超敏試劑盒分別選購(gòu)于兩個(gè)不同生產(chǎn)廠家。

1.2方法 選擇已知為陽(yáng)性的乳腺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，選擇PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。DAB顯色，嚴(yán)格按照相關(guān)的說(shuō)明書來(lái)進(jìn)行染色。三步法的具體操作如下：①對(duì)石蠟切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟直到水化，利用PBS對(duì)其進(jìn)行3次沖洗，沖洗時(shí)間為3 min/次；②利用EDTA緩沖液進(jìn)行浸泡，進(jìn)行2 min的高壓修復(fù)，暴露抗體；③切片加入150 Ll過(guò)氧化酶阻斷溶液，在室溫下進(jìn)行10 min孵育，從而來(lái)講內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性阻斷。采用PBS進(jìn)行3次沖洗，沖洗時(shí)間為3 min/次；④將PBS液去除，每張切片加正常非免疫動(dòng)物血清150Ll，在室溫下進(jìn)行10 min孵育；⑤將血清去除，每張切片加入第一抗體150 Ll；⑥采用PBS沖洗3次，沖洗時(shí)間為3 min/次，之后將PBS液去除，每張切片加入生物標(biāo)記的第二抗體150 Ll，在室溫下進(jìn)行10 min孵育，之后利用PBS沖洗3次，沖洗時(shí)間為3 min/次；⑦將PBS液除去，每張切片加入鏈霉菌抗生物素-過(guò)氧化酶溶液150 Ll，在室溫下進(jìn)行10 min孵育，之后利用PBS沖洗3次，沖洗時(shí)間為3 min/次；⑧將PBS去除，每張切片加入新鮮配置的DAB600Ll，在顯微鏡下進(jìn)行3～10 min的觀察；⑨采用自來(lái)水進(jìn)行沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗反籃或者在沖洗之后利用PBS快速反藍(lán)；⑩采用梯度酒精進(jìn)行脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠進(jìn)行封固。

二步法和三步法相比，4～7的操作不同，二步法不采用正常血清進(jìn)行封閉，直接加入第一抗體過(guò)夜，之后加入特異性二抗，其余操作步驟則和三步法相同。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將數(shù)據(jù)納入SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2比較，以率（%）表示，若（P<0.05）則差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

與二步法相比，三步法制片結(jié)果的陽(yáng)性率和背景低，非特異性著色小，結(jié)果比較明確易讀；而與三步法相比較，二步法的操作更加簡(jiǎn)單方便，檢查陽(yáng)性率和陽(yáng)性強(qiáng)度更高。

3討論

二步法也被稱之為非生物素酶法，二步法中的第二抗體是將特異性抗體和辣根過(guò)氧化物酶利用多聚糖骨架連接成多聚體[2]。通過(guò)PV系列二步法免疫組化檢測(cè)試劑，在氨基酸骨架上將二抗抗體分子和酶聚合在一起，形成一種多聚體，從而來(lái)代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法中的三抗和二抗，讓抗原和抗體的結(jié)合信號(hào)得到有效放大，防止再次采用生物素，之后在利用DAB呈色反應(yīng)來(lái)對(duì)抗原表達(dá)部位進(jìn)行觀察。

三步法也被稱之為生物素酶法，實(shí)驗(yàn)室采用的SP超敏試劑盒主要是利用鏈霉素抗生物蛋白-過(guò)氧化物酶鏈接系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)的。利用生物素對(duì)第二抗體進(jìn)行標(biāo)記；選擇從鏈霉菌中分離出的蛋白質(zhì)作為鏈霉菌抗生物素蛋白，這種蛋白質(zhì)的分子量為60KD，包含有亞基4個(gè)，每一個(gè)亞基都具有和生物素進(jìn)行相連的部位，而且亞基和生物素之間的親和力比較強(qiáng)。鏈霉菌抗生物素蛋白和過(guò)氧化物酶形成鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合體；生物素化的第二抗體和鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合體，利用DAB呈色反應(yīng)能將抗原抗體的結(jié)合部位有效顯示出來(lái)[3]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與二步法相比，三步法制片結(jié)果的陽(yáng)性率和背景低，非特異性著色小，結(jié)果比較明確易讀；而與三步法相比較，二步法的操作更加簡(jiǎn)單方便，檢查陽(yáng)性率和陽(yáng)性強(qiáng)度更高。免疫組化三步法染色的非特異性著色率低于二步法，主要原因是三步法在加入一抗之前，采用血清封閉將內(nèi)源性雜質(zhì)去掉，從而對(duì)染色非特異性著色率產(chǎn)生了干擾，而PV二步法則沒(méi)有這一步驟，所以免疫組化三步法染色的非特異性著色率更低。二步法的靈敏度更高，第一抗體在4e環(huán)境下過(guò)夜背景更容易著色，所以三步法的假陽(yáng)性率比二步法低，因此實(shí)驗(yàn)室在對(duì)C-MET陽(yáng)性率表達(dá)率進(jìn)行研究檢測(cè)時(shí)，可以選擇采用三步法來(lái)有效防止誤差。但是三步法的時(shí)間更長(zhǎng)，步驟較多，對(duì)操作人員也有比較高的要求，不容易檢測(cè)出陽(yáng)性表達(dá)率不高的患者，而二步法則具有較高的靈敏度，漏診的幾率不大，沒(méi)有內(nèi)源性生物素的影響，DAB顯色比較快，所以在臨床診斷時(shí)可以選擇二步法來(lái)進(jìn)行，這樣能更快得出診斷結(jié)果。

本研究主要針對(duì)的是胃癌上一抗為C-MET時(shí)的結(jié)果，對(duì)于其他檢測(cè)指標(biāo)，二步法和三步法是否也存在差異還需要進(jìn)一步的分析和探討。

參考文獻(xiàn)：

[1]蓋文君，姚宏.免疫組織化學(xué)染色技術(shù)SP三步法與PV二步法比較探討[J].山西醫(yī)藥雜志，2013，05.

[2]朱淑玲，楊清緒，趙文麗.兩種免疫組織化學(xué)方法結(jié)果比較[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，08：29-30.

[3]張菁.肝組織HBsAg及HBcAg的三種免疫組化方法標(biāo)記效果比較[J].臨床醫(yī)學(xué)，2010，10：5-6.

編輯/張燕