摘要：目的 探討不同濃度Hcy對單核泡沫細胞ERO1α mRNA和蛋白表達的影響。方法 培養(yǎng)單核源性泡沫細胞并給予不同濃度Hcy及葉酸和維生素B12干預后，分別運用實時定量PCR和Western blot檢測ERO1α mRNA和蛋白表達改變。結果 成功培養(yǎng)單核源性泡沫細胞并檢測ERO1α mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)隨著Hcy濃度升高，泡沫細胞ERO1α mRNA水平呈上升趨勢，且與Hcy濃度呈劑量依賴關系；同時給予葉酸和維生素B12后可明顯降低ERO1α mRNA水平。泡沫細胞ERO1α蛋白表達改變與mRNA變化趨勢一致。結論 ERO1α在Hcy促進單核泡沫細胞形成過程中發(fā)揮重要作用。

關鍵詞：同型半胱氨酸；單核泡沫細胞；內質網氧化還原酶-1α

同型半胱氨酸（Hcy）是動脈粥樣硬化等多種心腦血管疾病的獨立危險因子，但其具體致病機制尚不清楚[1]。THP-1單核泡沫細胞是動脈粥樣硬化斑塊的主要細胞類型，被認為是動脈斑塊形成的重要標志[2]。內質網氧化還原酶-1α（ER oxidoreduclin-1， ERO1α）是位于內質網膜上的一種黃素蛋白，其對內質網腔中蛋白合成、折疊起關鍵調控作用且與細胞內活性氧簇（ROS）生產密切相關[3]。研究表明Hcy可以影響細胞內過氧化及氧自由基含量等多種途徑促進動脈斑塊形成[4]。因此，本文主要探討不同濃度Hcy對單核泡沫細胞ERO1α表達的影響及葉酸和維生素B12對ERO1α的干預作用，為進一步明確Hcy導致AS的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

1資料與方法

1.1 材料 THP-1單核細胞株（寧夏醫(yī)科大學心腦血管疾病重點實驗室）；超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司，中國）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；5415D型微量臺式離心機（Eppendorf，德國）；熒光定量PCR儀（上海楓嶺生物技術有限公司，中國）；垂直電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；HyClone RPMI-1640培養(yǎng)基（Thermo）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所）；Hcy（Sigma）；RNA提取試劑盒（北京天根生物技術有限公司）；cDNA逆轉錄和qRT-PCR試劑盒（美國Invitrogen公司）；蛋白提取試劑盒 （南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；ERO1α兔抗人一抗（Abcam公司），辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術有限公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 THP-1單核泡沫細胞培養(yǎng)與分組 在THP-1單核細胞培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，傳代培養(yǎng)，以4×106/ml個細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入PMA使其終濃度為100 nmol·L-1，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細胞貼壁狀態(tài)，形狀不規(guī)則并有偽足伸出，證實THP-1單核細胞已分化為巨噬細胞。棄去舊培養(yǎng)液，更換為含終濃度50 mg·L-1 ox-LDL的不同濃度Hcy的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察泡沫細胞形成并用于后續(xù)實驗。分組以0 mol·L-1 Hcy泡沫細胞為對照組，不同濃度Hcy（50、100、200、500 mol·L-1）和500 mol·L-1 Hcy+葉酸+維生素B12（500+F+V）干預泡沫細胞，每組3瓶。

1.3 泡沫細胞油紅O染色 將干預后的泡沫細胞用PBS緩沖液洗3次，10%多聚甲醛固定10 min，60%乙醇浸泡1 min，油紅O染色10 min，60%異丙醇分色3 min，雙蒸水洗5 min，蘇木素染色1 min，雙蒸水洗待干后用水性封固劑封片，顯微鏡下觀察，細胞內脂質呈紅色，細胞核呈藍色。

1.4 實時定量PCR檢測ERO1α的mRNA水平 按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。按逆轉錄試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA；采用Primer5.0軟件設計人ERO1α引物，引物序列為上游：5'-ATCCTTTGGCTTCTGGTCAAG-3'，下游：5'-GTTGTGTCCCCATTTCTTTTC T-3'；以人GAPDH為內參；上游：5'-GGTGAAGGTCG

GTGTGAACG-3'，下游：5'-CTCGC TCCTGGAAGATGGTG-3'；PCR條件：94℃預變性10 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延長30 s，擴增40個循環(huán)。待反應結束后，結合擴增曲線及溶解曲線，選擇符合要求的qRT-PCR原始數(shù)據(jù)，結果用2-△△CT法分析。

1.5 Western blot檢測ERO1α的蛋白表達改變 細胞裂解法提取各組細胞蛋白，取總蛋白20μL，經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，80V 30min，120V 60min，15V恒壓轉膜10min，與ERO1α特異性一抗37 ℃溫育2h，4 ℃過夜；與二抗（含HRP標記的羊抗兔IgG）室溫孵育1.5 h后，加入顯色底物。以β-actin為內參，凝膠成像分析儀上成像分析，計算ERO1α與β-actin灰度值的比值，進行分析。

1.6 統(tǒng)計分析 采用Prism 5.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以（ x±s）表示，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1泡沫細胞鑒定 油紅O染色后光鏡下可見細胞內有大量的紅色脂質顆粒存在，且個別細胞由于吞噬的脂滴過多而使體積增大，符合泡沫細胞的形態(tài)學特征。

2.1 不同濃度Hcy干預泡沫細胞后ERO1 mRNA表達變化 使用0、50、100、200、500 μmol·L-1不同濃度Hcy干預泡沫細胞后，檢測ERO1α mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)，Hcy可以增加泡沫細胞ERO1α mRNA表達水平，且隨著Hcy濃度增加，ERO1α表達增多（P<0.05），呈劑量依賴關系。給予500μmol·L-1Hcy加葉酸和維生素B12干預后，ERO1α表達降低（P<0.05）。

2.2 不同濃度Hcy干預泡沫細胞后ERO1蛋白表達變化 使用不同濃度Hcy干預泡沫細胞后，檢測ERO1α 蛋白水平變化發(fā)現(xiàn)，與0 μmol·L-1組比較，Hcy可以增加泡沫細胞ERO1α蛋白表達，且隨著Hcy濃度增加，ERO1α表達增加（P<0.01），呈劑量依賴關系。同時，給予葉酸和維生素B12干預后，ERO1α蛋白表達水平降低。

3討論

大量的臨床和流行病學證據(jù)表明同型半胱氨酸（Hcy）是動脈粥樣硬化的獨立危險因子。Hcy致動脈粥樣硬化的可能機制包括氧化應激反應增強，NO的生物活性降低導致內皮功能失調，促進平滑肌細胞增殖，促進脂蛋白氧化和血小板活化，泡沫細胞在內皮下聚集，增強凝血作用，以及增加肝細胞膽固醇的合成等[5]。Hcy 作為蛋氨酸的中間代謝產物，含有活潑的自由巰基（-SH），極易發(fā)生自身氧化，生成超氧化物、過氧化氫和羥基自由基等多種強氧化物，導致機體氧化還原態(tài)失衡，啟動脂質過氧化鏈式反應而損傷細胞，加速細胞內低密度脂蛋白（LDL）氧化成為ox-LDL，促進巨噬細胞吞噬ox-LDL 形成泡沫細胞[6]。然而，Hcy如何促進體內過氧化物質產生及堆積的分子機制仍不清楚。我們的研究結果為這一問題給出了可能的解釋：Hcy可以促進單核泡沫細胞ERO1α表達增加，且與Hcy濃度改變呈劑量依賴關系。

內質網氧化還原酶l （ERO1α）是ER腔內氧化當量的重要來源，主要維持ER內氧化狀態(tài)。同時EROlα激活也是細胞內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生的重要來源。尤其在大量分泌蛋白質時，經粗略估算超過25%的ROS是在蛋白質分泌時產生的，當ROS的產生超過抗氧化防御能力的時候，過多的ROS會影響細胞內氧化還原穩(wěn)態(tài)，產生氧化應激等損傷反應[7]。因此，ERO1α可能在Hcy促進單核泡沫細胞形成，體內氧化物質堆積中發(fā)揮重要作用，這位我們進一步研究Hcy的致病機制提供的重要線索。

葉酸和維生素B12作為Hcy代謝的輔助因子在體內發(fā)揮重要作用。葉酸和維生素B12缺乏可明顯升高Hcy水平。已經證實葉酸治療在降低血漿Hcy水平的同時，還具有獨立的抗氧化作用，而且能夠增加NO合酶的活性，這些都能抑制早期動脈粥樣硬化的形成[8]。在Hcy促進泡沫細胞形成過程中，同時給予葉酸和維生素B12后可以降低ERO1α表達，這進一步說明了ERO1α在Hcy引起的氧化損傷中發(fā)揮重要作用。

綜合以上實驗結果，我們分析了ERO1α在Hcy誘導的單核泡沫細胞形成中發(fā)揮重要作用，且其可能是調控細胞過氧化的重要調控基因，這為我們進一步認識Hcy致動脈粥樣硬化硬化提供了新的線索和干預靶點。

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編輯/馮焱