摘要：目的 建立一種中國人群運動性猝死相關基因多態(tài)性速測方法。方法 用Chelex法提取外周靜脈血基因組DNA，應用定點突變技術獲得運動性猝死相關基因的突變陽性DNA模板，然后通過等位基因特異性（allele-specific， AS）PCR法擴增目的基因。優(yōu)化內參引物、多態(tài)引物的Tm值，引物濃度比例，PCR循環(huán)數(shù)等擴增條件；瓊脂糖凝膠電泳進行基因分型。結果 AS-PCR可檢測運動性猝死相關基因多態(tài)性，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠分型與DNA測序結果完全一致。結論 本研究建立的AS-PCR方法適用于中國人群運動性猝死相關基因的快速檢測。

關鍵詞：運動性猝死；基因多態(tài)性；等位基因特異性PCR

中圖分類號：G804.83

Abstract：Objective To establish a simple method for testing exercise sudden death gene of Chinese. Methods Firstly， extract genomic DNA from peripheral venous blood. Secondly， use fixed point mutation technique to get the positive template， and then use the allele specific （allele specific， AS） PCR to amply the target gene. Thirdly， optimize the Tm value and concentration ratio of primers， PCR cycle number and a series of amplification conditions. Finally， analyze the PCR product by agarose gel electrophoresis and sequencing. Results The AS-PCR can detect sudden cardiac death gene polymorphism， the agarose gel electrophoresis genotyping results of PCR product coincide exactly with the result of DNA sequencing .Conclusion This new method established and optimized can be used for rapid detection of exercise sudden death related genes.

Key words：Exercise sudden death；Genetic polymorphism；Allele specific PCR

近年來，高強度競技體育運動項目（如足球、馬拉松）運動性猝死案例頻發(fā)，并且其數(shù)量呈逐年上升的態(tài)勢。目前，臨床對運動性猝死的常規(guī)檢測手段主要有家族史、個人史篩查，體格及心電圖檢查，若為陽性結果，則進一步查超聲心動圖、運動負荷試驗和24h動態(tài)心電圖等[1]。但這些檢測方法針對性不強，檢出率低，具有較大的局限性。國內外對運動性猝死的研究表明[2]，死者的某些基因存在突變，大多表現(xiàn)為SNP或堿基缺失多態(tài)性。

在離子通道基因突變導致運動性猝死方面的研究，國內外均有相關報道，并初步確定了運動性猝死相關基因及其突變位點[3]。鈉離子通道是一種跨膜糖蛋白，位于細胞質膜上， 由A、B亞單位組成，主要選擇性允許鈉離子通過， 維持細胞興奮性及其傳導[4]。編碼鈉離子通道的基因突變會導致其相應的通道蛋白結構與功能異常， 從而引發(fā)一類心律失常疾病[5]。鉀離子通道是亞型最多、作用最復雜的一類離子通道。編碼鉀離子通道的基因突變導致的鉀通道功能異?？梢詫е露喾N心律失常綜合癥[6]。國內外文獻報道研究較多的鉀離子通道基因有KCNE1，KCNH2，KCNJ11。KCNE1基因編碼人類心肌緩慢激活的延遲整流性鉀通道蛋白的B亞單位，該通道在心肌動作電位復極期起重要作用[7]。有文獻報道[8]，中國漢族人群中廣泛存在KCNE1-S38G 多態(tài)性改變，KCNE1—38S 型可能與室性心動過速發(fā)病相關。Jeron等[9]發(fā)現(xiàn)在AMI并發(fā)猝死患者的KCNJ11基因上出現(xiàn)2個錯義突變（ P266T和R371H）， 這2個突變導致了氨基酸序列的改變， 誘發(fā)折返性心律失常。CACNA1C和CACNB2B是編碼鈣離子通道的基因，體外實驗證明這兩個基因的突變導致L型鈣通道功能獲得性突變， QT間期延長，從而誘發(fā)心律失常[10]。NUP155是編碼核孔復合物組分的基因，主要控制mRNA由細胞核到細胞質的轉運，能夠對其他很多基因和蛋白質的表達進行調控，研究表明[11]，NUP155基因的一些細微改變，有可能增加常見的散發(fā)性房顫發(fā)生的危險性。本研究選取KCNH2、KCNE1、SCN5A、KCNJ11、NUP155、CACNA1C、CACNB2b，7個與運動性猝死顯著相關的熱點突變基因的多態(tài)位點作為靶點，以AS-PCR方法為檢測手段，從而建立準確、快速篩查運動性猝死基因多態(tài)性的方法。

1 資料與方法

1.1主要試劑及儀器 Chelex-100購自上海生物工程公司；定點突變試劑盒MutanBEST Kit ，PMD18—TVector，PCR擴增試劑包括TaKaRa Taq Hot Start DNA熱啟動Taq酶，dNTPs，Buff以及核酸電泳分析試劑DL1000 DNA分子量標準，DNA無毒染料，瓊脂糖，均購自日本Takara公司；Bigdye3.1DAN測序試劑盒，購自美國Life公司。主要儀器設備有：美國ABI9700型PCR擴增儀，英國UVR電泳凝膠成像系統(tǒng)，美國ABI3130型DNA測序儀。

1.2基因組DNA提取 50例猝死個體臨床血液樣本，采用Chelex基因組DNA 提取試劑盒， 參照使用說明書操作， 提取基因組DNA。取直徑3～5mm血斑置于1.5ml離心管中，加入sdH2O1ml，振蕩離心，棄上清，重復步驟2次，棄上清，將5%Chelex-100振蕩懸浮后快速用剪掉頭的槍頭吸取200μl 加入離心管中，振蕩數(shù)秒，于56℃水浴保溫30min后，振蕩數(shù)秒，95℃沸水浴10min，輕微振蕩數(shù)秒。2000rpm離心5min，上清為提取的DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?.3陽性模板制備 根據(jù)7個靶基因SNP位點設計突變引物，并進行PCR擴增，將引入突變位點的目的片段克隆到pMD18-TVector載體中（利用Takara MutanBest Kit對PCR產(chǎn)物進行末端平滑化及5′磷酸（P）化處理，高效連接試劑Ligation Solution I進行自身連接，然后轉化、提取攜帶突變位點的質粒DNA），測序驗證后作為后續(xù)PCR的DNA模板。

1.4 AS-PCR引物設計 根據(jù)Genbank中的靶基因序列和AS-PCR原理，采用primer premier 5軟件設計多態(tài)引物及內參引物，針對變異位點設計一對等位基因特異性引物（AS引物），其3′末端分別與變異位點的堿基互補。為增加擴增特異性和檢測分辨率，在3′端第2 位引入錯配堿基的AS-PCR引物。同時為排除PCR反應系統(tǒng)敏感性所致基因型判斷失誤， 在AS 引物上游設計了內參引物PF，下游共用引物PR與其中一種AS 引物用作突變檢測。內參引物與下游共用引物擴增較大的片段作為PCR 的質控參照。AS-PCR引物設計原理示意圖如圖1。

圖1 AS-PCR引物設計原理示意圖

本實驗采用半巢式PCR的方法進行擴增，SNP多態(tài)引物及內參引物序列如表1所示。

表1 心源性猝死相關基因AS-PCR引物序列

基因名稱 序列 注釋

KCNE1 5'-GTGCCTGGGAAGTTTGAGC-3' F

5'-GCAGGTCCCCCCGCAGAA-3' P

5'-GCAGGTCCCCCCGCAGAG-3' P

5'-CCGTTCTTTCCCAGTCTCAT-3' R

KCNH2 5'-GCCGTGCTGTTCTTGCTC-3' F

5'-AGGACAAGTATGTGACGGCTC-3' P

5'-AGGACAAGTATGTGACGGCTT-3' P

5'-GATTGGGGATCTGGTGGAA-3' R

SCN5A 5'-ACAGTGATGCTGGCTGGAAG-3' F

5'-GAAGTACTTCTTCTCCCCGTC-3' P

5'-GAAGTACTTCTTCTCCCCGTT-3' P

5'-ATGTTGATGAGGCTTATCTGGTT-3' R

KCNJ11 5'-CTCATCGTGCAGAACATCGTG-3' F

5'-CGCAAGAGCATGATCATCCA-3' P

5'-CGCAAGAGCATGATCATCCG-3' P

5'-TGGCCGGGCTACATACCA-3' R

CACNA1C 5'-GCCTGCAATAGCTTGAAATAAGG-3' F

5'-GGTGGGGATGTGCTCAGGTA-3' P

5'-GTGGGGATGTGCTCAGGTG-3' P

5'-AGAAGGGAAAGAAGGGAATGAG-3' R

CACNB2B 5'-GCACTTGCTCTGGGACAT-3' F

5'-CCCAGCACCGCTCTTCCGC-3' P

5'-TCCCAGCACCGCTCTTCCGT-3' P

5'-TGATTCTGGCTTGTTGGATA-3' R

NUP155 5'-GGAGAATCGCTTGAACCC-3' F

5'-CTGACGCTGGTTCATGTCAA-3' P

5'-CTGACGCTGGTTCATGTCAG-3' P

5'-TATTGCGTGGTGCTAAGGTT-3' R

注：F為上游引物；P為多態(tài)引物；R為下游引物

1.5AS-PCR 反應及條件優(yōu)化

1.5.1 AS-PCR反應 本實驗的反應條件為95℃、3min，94℃、30s，55～65℃、30s，72℃、30s；72℃、3min，共35個循環(huán)。PCR緩沖液（其中，Tris-HClpH8.3，100mM；KCl，500，Mm； MgCl2，15mM），dNTPs混合物的各組分濃度為2.5mM，熱啟動Taq酶（Taq HS）為5U/μl，內參上游引物的濃度為10uM，多態(tài)性引物的濃度為10uM，下游引物的濃度為10uM。

1.5.2溫度梯度PCR優(yōu)化退火溫度 平行進行56管反應， 設定溫度梯度范圍為55～65℃， 各管的退火溫度分別為：55.0、56.3、57.6、59.1、60.7、62.2、63.8、65.0。反應條件同上，反應產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像儀觀察，選擇無非特異條帶，特異性條帶最亮的管所對應退火溫度為后續(xù)反應的退火溫度。

1.5.3引物濃度優(yōu)化 本實驗采用半巢式PCR的方法進行擴增，因此存在PCR競爭的情況。將內參引物與目的基因引物的比例進行引物濃度優(yōu)化。反應產(chǎn)物經(jīng)用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離， 凝膠成像儀觀察， 選擇內參條帶與目的條帶亮度比例適中，便于判讀的引物比例為后續(xù)反應的引物濃度。

1.5.4 DNA測序驗證AS-PCR擴增產(chǎn)物 為了進一步驗證采用一系列AS-PCR擴增條件優(yōu)化后的產(chǎn)物多態(tài)性的準確性，通過PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠回收試劑盒將擴增產(chǎn)物回收。由去離子甲酰胺與分子量內標組成上樣混合物（0.2μl分子量內標×進樣數(shù)+9.8μl去離子甲酰胺×進樣數(shù)），將10μl上樣混合物與1μl擴增產(chǎn)物或等位基因分析標準物混合，避免產(chǎn)生氣泡，95℃變性5min，冰浴后電泳，用ABI3130遺傳分析儀檢測分析。

2 結果

2.1陽性模板的制備 本研究根據(jù)7個基因SNP位點，應用定點突變技術在野生型的基礎上得到相應的DNA陽性模板，各個基因的SNP多態(tài)性如表2所示。

表2 心源性猝死相關基因SNP多態(tài)基因型

基因名稱

基因型 KCNE1 KCNH2 SCN5A KCNJ11 CACNA1C CACNB2BNUP155

野生型 AACC CC GG GG CC GG

突變型 A/G GGC/T C/T TT A/G A/G C/T A/G

2.2 AS-PCR 反應條件優(yōu)化 運用AS-PCR方法同時檢測這7個SNP多態(tài)位點。為了實現(xiàn)運動性猝死基因檢測的高效性，特異性，要求各個PCR擴增反應的Tm值（退火溫度）基本一致，而由于半巢式PCR方法擴增目的基因，存在PCR引物競爭，選擇最優(yōu)的退火溫度和引物濃度的電泳，如圖3所示。檢測的7個基因中，KCNE1基因的參考片段大小為894bp，目的條帶大小為754bp；KCNH2基因的參考片段大小為760bp，目的條帶大小為579bp；KCNJ11基因的參考片段大小為795bp，目的條帶大小為624bp；SCN5A基因的參考片段大小為764bp，目的條帶大小為698bp；CACNA1C基因的參考片段大小為851bp，目的條帶大小為203bp；CACNB2B基因的參考片段大小為914bp，目的條帶大小為750bp；NUP155基因的參考片段大小為610bp，目的條帶大小為321bp。

圖3

2.3檢測樣本的基因分型及測序驗證 檢測50個猝死個體的血液樣本，結果如表3，其中9號、22號，27號，40號樣本檢出陽性結果，將陽性樣本的PCR產(chǎn)物回收，經(jīng)ABI3130測序儀測序，瓊脂糖凝膠得到的基因分型結果與測序結果完全一致。電泳圖和測序，如圖4所示。9號樣本運動性猝死基因分型電泳圖中，1號泳道和2號泳道700bp位置左右出現(xiàn)目的擴曾條帶，大小與理目的條帶理論值698bp吻合，檢為A/G雜合，與測序結果一致，表明該個體存在潛在的猝死風險；27號樣本運動性猝死基因分型電泳圖中，4號泳道700bp位置左右出現(xiàn)目的擴曾條帶，大小與理目的條帶理論值698bp吻合，3號泳道無目的條帶出現(xiàn)，檢為GG純合，與測序結果一致，表明該個體存在較高的猝死風險；22號樣本運動性猝死基因分型電泳圖中，5號泳道和6號泳道700bp位置下方出現(xiàn)目的擴曾條帶，大小與理目的條帶理論值579bp吻合，檢為C/T雜合，與測序結果一致，表明該個體存在潛在的猝死風險；40號樣本運動性猝死基因分型電泳圖中，7號泳道和8號泳道300bp位置左右出現(xiàn)目的擴曾條帶，大小與理目的條帶理論值321bp吻合，檢為A/G雜合，與測序結果一致，表明該個體存在潛在的猝死風險。

圖4

3 討論

本研究檢測的50個猝死樣本中，發(fā)現(xiàn)KCNE1基因的兩種突變型各1例，KCNH2基因突變1例。臨床研究結果顯示，中國漢族人群中廣泛存在KCNE1、KCNH2、KCNJ11單核苷酸多態(tài)性改變，從而導致室性心動過速的猝死。因此，鉀離子通道相關基因導致的猝死屬于高?；蛲蛔冃停晃窗l(fā)現(xiàn)鈉離子通道相關基因SCN5A，鈣離子通道相關基因CACNA1C、CACNB2B的突變，這兩類基因突變導致的運動性猝死在人群中分別約占1～5‰和0.1～0.3‰，屬于低度危險突變型；發(fā)現(xiàn)NUP155基因的突變1例，據(jù)文獻報道[11]，編碼核孔復合物組分的基因NUP155基因是中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)的與運動性猝死顯著相關的特有基因。50例猝死樣本中，檢出4例與本研究靶基因相關的陽性突變?？赡艿脑蚴牵阝赖臉颖局?，除了有心源性猝死外，還有腦源性猝死，或者其他原因的導致的猝死。而且在猝死的案例中，因基因突變導致心功能受損而發(fā)生猝死的比例也較其它原因猝死概率低。從猝死樣本檢測出4例基因突變陽性樣本，表明本研究所采用的方法可靠，結果準確，但是，與鈉離子、鈣離子通道相關的3個基因型沒有檢測到臨床陽性樣本，因此還須通過篩查大量的臨床猝死樣本來確保檢驗方法的可靠性。

引物設計、PCR反應條件是決定AS-PCR特異性和敏感性的重要環(huán)節(jié)。本研究在AS引物的倒數(shù)第2位引入錯配堿基大大提高了檢測特異性，而在設計引物和實驗中進行一系列優(yōu)化最終將7個基因的退火溫度統(tǒng)一則大大提高了檢測的效率。但是，AS-PCR方法也存在一定的局限性，比如：當基因數(shù)目較多，由于引物數(shù)量和PCR擴增的數(shù)量增多，同時需要優(yōu)化大量的實驗條件，而且很難將所有基因的退火溫度統(tǒng)一起來；當同一個基因的位點較多時也存在這種情況。此外，由于不同引物的反應條件不同，混合在一起引物競爭的情況比較復雜，不能將所有的檢測位點于1管PCR反應中完成，檢測通量受到限制。因此。AS-PCR方法在檢測通量方面仍然有很大的提升空間，希望在后續(xù)的研究中能夠結合多重PCR等技術來擴展其檢測通量和應用范圍。

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