王 珺 董文賓 楊芙蓮 高二東 緱敬軒

(陜西科技大學(xué)，陜西西安 710021)

硒是氧族元素，具有金屬和非金屬特性［1］。硒可以增強自由基的清除能力，提高體內(nèi)的抗氧化能力，此外硒還有提高免疫能力［2－4］、降血脂、抗腫瘤［5－7］、抗疲勞、解毒、防治心腦血管疾病、提高生殖機能、預(yù)防老年性疾病、預(yù)防多種地方性疾病等多重功效。茶葉中所含蛋白質(zhì)的量為茶葉干重的15%～30%。胡秋輝等［8］的研究發(fā)現(xiàn)茶葉中的硒大部分都與蛋白質(zhì)相結(jié)合，其蛋白硒的含量占有機硒含量的79.56% ～88.70%。目前中國對茶葉蛋白提取方法研究較多的為堿法提?。?］、酶法提?。?0］、鹽法提?。?1］、超聲輔助提?。?2］和反復(fù)凍融法輔助提?。?3］，硒蛋白多采用傳統(tǒng)堿法進行提取，提取液一般選用NaOH［14－16］。反復(fù)凍融法輔助提取是利用低溫冰箱把提取液于 －40 ℃冷凍1 h，然后加熱溶化，反復(fù) 3 次［17，18］，在凍融過程中實現(xiàn)細胞壁破碎的目的，使得硒蛋白更容易被提出。

本研究擬通過三凍三融技術(shù)輔助傳統(tǒng)堿提法提取硒蛋白，研究在輔助手段影響下液固比、提取溫度、提取液濃度、提取時間以及提取次數(shù)等因素對硒蛋白提取率的影響，進而使富硒茶茶渣中硒蛋白提取率大幅度升高，提高富硒茶利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

富硒夏秋茶茶粉:陜西安康紫陽富硒綠茶有限責任公司;

乙醇:分析純，天津市富宇精細化工有限公司;

牛血清蛋白:分析純，上海勵瑞生物科技有限公司;

考馬斯亮藍G-250、磷酸、NaOH:分析純，天津市富宇精細化工有限公司;

HCl、K2SO4:分析純，北京化工廠;

H2SO4:分析純，成都市科龍化學(xué)試劑有限責任公司;

CuSO4:分析純，西安市科洛試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

移液槍:DV31142型，大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)總部;

萬分之一電子天平:BT354S-XM型，北京賽爾斯精密儀器有限公司;

電熱鼓風(fēng)干燥箱:101-1AB型，天津市泰斯特儀器有限公司;

精密增力電動攪拌器:JJ-1型，常州國華電器有限責任公司;

低速離心機:TM-7706型，上海湘儀科學(xué)儀器有限公司;

真空干燥箱:DZ-1BC型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;

精密pH計:PHS-3C型，北京賽爾斯精密儀器有限公司;

可見光分光光度計:UV-2800型，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 硒蛋白含量測定 采用凱氏定氮法。按GB 5009.5—2010執(zhí)行，蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.32。

1.2.2 硒蛋白的提取 稱取5 g茶粉用75 mL 40%乙醇60℃水浴浸提15 min，離心(3 500 r/min，10 min)后去除上清液，重復(fù)2次，茶渣干燥至恒重。加一定濃度的NaOH溶液于茶渣中水浴攪拌浸提(200 r/min)，然后在－40℃條件下冷凍1 h，水浴加熱使其融化，反復(fù)3次后以3 600 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min取上清液，此上清液即為硒蛋白提取液，用1 mol/L的鹽酸調(diào)上清液pH值至等電點，靜置15 min后離心(8 000 r/min，15 min)，沉淀干燥至恒重即為硒蛋白粗品。用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)測定硒蛋白粗品中的蛋白質(zhì)含量，以此來計算提取率。每組做3次平行試驗，取其平均值。

蛋白質(zhì)提取率的計算公式見式(1):

1.2.3 硒蛋白等電點的確定 稱取去酚后的茶渣4.000 g，在液固比60∶1(V∶m)，NaOH濃度為0.1 mol/L，提取溫度為60℃的條件下提取2次，離心后合并提取液。取20 mL硒蛋白提取液分別裝入8支按順序編號試管中，依次用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)使得提取液的pH值分別為 5.5，5.0，4.5，4.0，3.5，3.0，2.5，靜止 10 min用轉(zhuǎn)速為3 600 r/min的機器離心，以此測定上清液蛋白含量，殘留量最低即是硒蛋白質(zhì)等電點。

1.2.4 硒蛋白提取工藝的優(yōu)化 本試驗在三凍三融技術(shù)的輔助下，分別考察了液固比、提取液濃度、提取溫度、提取時間以及提取次數(shù)對硒蛋白提取率的影響。

(1)液固比的影響:分別稱取5 g經(jīng)去酚后的茶渣，選取10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1，80∶1(V∶m)，提取液為0.1 mol/L NaOH，70℃下水浴攪拌提取3 h，考察液固比對硒蛋白提取率的影響。

(2)堿液濃度的影響:分別稱取5 g經(jīng)去酚后的茶渣，以50∶1(V∶m)的液固比，將其分別溶解于濃度為0.05，0.10，0 .15，0.20，0.25，0.30 mol/L 的 NaOH 溶液中，在 70 ℃下水浴攪拌提取3 h，考察堿液濃度對硒蛋白提取率的影響。

(3)提取溫度的影響:分別稱取5 g經(jīng)去酚后的茶渣，以液固比為50∶1(V∶m)，提取液為0.1 mol/L NaOH在提取溫度分別為 30，40，50，60，70，80，90，100 ℃的條件下水浴攪拌提取3 h，考察提取溫度對硒蛋白提取率的影響。

(4)提取時間的影響:分別稱取5 g經(jīng)去酚后的茶渣，以液固比為50∶1(V∶m)，提取液為0.1 mol/L NaOH，70℃分別水浴攪拌提取 1，2，3，4，5，6，7，8 h，考察提取時間對硒蛋白提取率的影響。

(5)提取次數(shù)的影響:分別稱取5 g經(jīng)去酚后的茶渣，以濃度為0.1 mol/L NaOH按液固比50∶1(V∶m)分別提取1，2，3，4次，溫度為70℃，每次提取時間為3 h。首次提取過后把第一次提取后余留殘渣用同方法再提取一次，以此類推，測定不同提取次數(shù)所得提取物中蛋白含量?？疾焯崛〈螖?shù)對硒蛋白提取率的影響。

1.2.5 硒蛋白粗品的純化 準確稱取4.000 g硒蛋白粗品(硒蛋白粗品由本試驗研究所得的最優(yōu)提取工藝提取)，加入40%乙醇溶液60 mL，在60℃下水浴1.5 h，以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min取其沉淀，60℃下烘至恒重后測定其純度。其中硒蛋白含量的測定用凱氏定氮法(GB 5009.5—2010)。每組做3次平行試驗，取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 硒蛋白的標準曲線

由圖1可知，蛋白質(zhì)含量在0～100 μg時呈線性良好，其線性方程為 y=0.007 0x+0.008 3，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3。

2.2 硒蛋白等電點的確定

圖1 蛋白質(zhì)標準曲線Figure 1 The standard curve of protein

圖2 硒蛋白等電點Figure 2 The isoelectric point of selenoproteins

由圖2可知，上清液中蛋白質(zhì)殘留率在pH為3.5時最低，即在此pH值下硒蛋白膠體溶液最不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)沉淀量最多，也最接近等電點。因此，選取pH=3.5為硒蛋白的等電點，用以沉淀硒蛋白。

2.3 硒蛋白提取工藝的優(yōu)化

2.3.1 液固比對提取率的影響 由圖3可知，硒蛋白提取率隨液固比增加先增后減，在70∶1(V∶m)時提取率達到最大值40.81%。說明在液固比為70∶1(V∶m)時，硒蛋白在堿液中的溶解度已經(jīng)飽和，而過量的堿液會破壞氨基酸的結(jié)構(gòu)，然而在液固比50∶1，60∶1(V∶m)時，提取率分別為38.54%和38.61%。綜合考慮提取率和耗堿耗水等生產(chǎn)成本，最終確定液固比為50∶1(V∶m)。

圖3 液固比對提取率的影響Figure 3 Effect of liquid-solid on the extraction rate for selenoproteins

2.3.2 提取液濃度對提取率的影響 由圖4可知，硒蛋白質(zhì)提取率隨NaOH濃度遞增而先增后減，在NaOH濃度在0.10 mol/L時，提取率最大達到35.58%。因為隨著NaOH濃度的增大，對蛋白質(zhì)和氨基酸的破壞越大，最終導(dǎo)致提取率降低。而且NaOH濃度過高不僅降低硒蛋白的質(zhì)量，還對提取設(shè)備和環(huán)境造成不利影響。因此，選取NaOH濃度0.10 mol/L最佳。

2.3.3 溫度對提取率的影響 由圖5可知，硒蛋白提取率隨溫度的增加而降低。在70℃時硒蛋白提取率最大達到41.69%。下降原因可能是溫度過高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)和細胞中其他物質(zhì)結(jié)合，從而影響提取效果。而且溫度越高，對硒蛋白的結(jié)構(gòu)破壞越大，還造成能耗過高，增加生產(chǎn)成本，所以，提取溫度確定為70℃。

圖4 堿液濃度對提取率的影響Figure 4 Effect of Alkali concentration on the extraction rate for selenoproteins

圖5 溫度對提取率的影響Figure 5 Effect of temperature on the extraction rate for selenoproteins

2.3.4 提取時間的影響 由圖6可知，硒蛋白的提取率隨著提取時間的增長而先增后減，在提取時間為3.5 h時，提取率最高達到45.05%。這可能是由于時間過長，堿液對蛋白質(zhì)破壞越大，導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失變大，最終影響蛋白質(zhì)的提取率。此外，時間過長能耗變大，生產(chǎn)成本增加，因此綜合考慮。確定提取時間為3.5 h，提取率可達45.05%。

圖6 提取時間對提取率的影響Figure 6 Effect of extracting time on the extraction rate for selenoproteins

2.3.5 提取次數(shù)對提取率的影響 由圖7可知，增加提取次數(shù)，提取率逐漸降低。綜合考慮提取率和能耗、設(shè)備折舊等因素，確定提取次數(shù)為2次。

圖7 提取次數(shù)對提取率的影響Figure 7 Effect of extraction Frequency on the extraction rate

2.3.6 正交優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計了以液固比、堿液濃度、提取時間和提取溫度的4因素3水平即L9(34)，進行正交試驗，以此正交試驗進一步優(yōu)化硒蛋白提取的工藝參數(shù)。正交試驗因素水平見表1，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design

由表2和3可知，4個因素中液固比相對于提取時間有顯著差異，堿液濃度和提取溫度相對于提取時間都有極顯著差異。因此以上4個因素在硒蛋白提取過程中影響大小的先后順序為:堿液濃度、提取溫度、液固比、提取時間。由此得出最宜提取組合為 A3B2C1D2，即采用液固比為60∶1(V∶m)，NaOH溶液濃度為0.10 mol/L，在70℃的條件下提取2次，每次提取3 h。

2.3.7 驗證實驗 驗證實驗按照最佳組合A3B2C1D2進行，最終測得硒蛋白粗品的提取率為60.93%，與正交所得結(jié)果基本一致，證實了提取硒蛋白的最佳工藝條件為:NaOH溶液濃度0.10 mol/L，液固比60∶1(V∶m)，提取溫度70℃，提取次數(shù)2次，每次提取3 h。

2.4 粗蛋白純化

由表4可知，準確稱取4.000 g硒蛋白粗品(硒蛋白粗品為本試驗所得最優(yōu)提取工藝提取)，經(jīng)過乙醇沉淀進行初步純化，可得到純度為78.26%的蛋白質(zhì)，純化過程中蛋白質(zhì)的損失率為7.21%。

表2 試驗結(jié)果Table 2 Results of the experiment

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table of orthogonal

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table of orthogonal

因正交表的四列已被占滿，且C因子的均方較小，所以將C作為誤差項進行方差的分析以及F值的檢驗。

因素 偏差平方和自由度F值Fa+0.05Fa+0.01顯著臨界值 臨界值 性A 29.481 2 27.734 19.000 99.000*1.063 2 B 1 106.045 2 1 040.494 19.000 99.000 ＊＊D 130.771 2 123.021 19.000 99.000 ＊＊誤差(C)

表4 粗蛋白初步純化結(jié)果Table 4 Purification results of the crude protein %

3 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明以反復(fù)凍融法輔助堿提法提取硒蛋白可有效提高其提取率，較高二東等［19］利用超聲輔助浸提硒蛋白的提取率增長了20%，可有效提高其經(jīng)濟效益。利用反復(fù)凍融輔助手段使細胞壁破損，硒蛋白更易被提取出來，且提取過程中不加入其他試劑，相較酶提取法試劑更加單一。然而反復(fù)凍融輔助提取時間長、步驟繁雜，有待進一步研究。

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