董文麗 徐 剛

(重慶科技學(xué)院，重慶 401331)

鐵是人體必需的微量元素之一，可以參與血蛋白，細(xì)胞色素及各種酶的合成［1，2］。生物醫(yī)學(xué)研究證明［3］，微量元素的濃度與人體健康之間具有越來(lái)越多的相關(guān)性，因此研究測(cè)定食品中微量鐵具有重要意義。微量鐵的測(cè)定方法主要有原子吸收光譜法［4，5］、分光光度法［6］、伏安法［7］、高效液相色譜法［8］、熒光分析法［9，10］等。中國(guó) GB/T 5009.90—2003《食品中鐵、鎂、錳的測(cè)定》采用火焰原子吸收法，但由于該法靈敏度不高，對(duì)于一些鐵含量較低的樣品分析受到限制。而熒光分析法以其靈敏度高、選擇性好及操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于環(huán)境水樣［11］、食品［12］及藥品［13］中微量鐵的測(cè)定。羅丹明B(rhodamine B，RB)屬于“三苯甲烷類”試劑，本身具有很強(qiáng)的熒光性及絡(luò)合能力，可以跟許多物質(zhì)反應(yīng)形成離子締合物，導(dǎo)致RB分子本身的內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)某些陰陽(yáng)離子的檢測(cè)分析。迄今尚未有關(guān)于RB熒光猝滅法測(cè)定微量鐵的研究報(bào)道，本研究擬根據(jù)在鹽酸介質(zhì)中，F(xiàn)e3+與過(guò)量KI反應(yīng)后生成I3－，I3－與RB形成離子締合物，使RB分子內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅，熒光猝滅值的大小與體系中Fe3+濃度在一定范圍內(nèi)成正比，從而建立起Fe(Ⅲ)—KI—RB體系熒光猝滅法間接測(cè)定微量鐵的新方法。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

熒光光譜儀:LS55型，美國(guó)PE公司;

高通量密閉微波消解系統(tǒng):CEM MARS型，美國(guó)培安科技公司;

原子吸收分光光度計(jì):AA-702型，北京東西分析儀器有限公司(儀器使用條件:燈電流5 mA，光譜通帶0.2 nm，波長(zhǎng)248.5 nm，燃燒器高度6 mm);

電子天平:BP211D型，德國(guó)賽多利斯公司;

濃鹽酸、30%過(guò)氧化氫:優(yōu)級(jí)純，成都金山化學(xué)試劑有限公司;

聚乙烯醇 PVA-124、乳化劑OP-10、羅丹明B:分析純，重慶川東化學(xué)試劑廠;

RB溶液(儲(chǔ)備液):1.0×10－3mol/L，使用時(shí)稀釋至 1.0 ×10－5mol/L;

鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/mL):準(zhǔn)確稱取 0.014 3 g Fe2O3(99.99%)于100 mL燒杯中，加入5 mL HCl(6 mol/L)溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量中，用一級(jí)去離子水稀釋至刻度，搖勻，此溶液為100 μg/mL的鐵(III)標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)稀釋成1 μg/mL的鐵工作液;

生花生:2013年8月采集于貴州務(wù)川;

試驗(yàn)用水為一級(jí)去離子水，所用試劑除特別說(shuō)明外，均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)的選擇 于25 mL比色管中分別加入1 μg/mL 鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.00，4.00 mL，10%的碘化鉀溶液1.00 mL，1 mol/L 的 HCl 2.00 mL，混勻后稀釋至 10 mL，靜置10 min后，再加入 1.0 ×10－5mol/L RB 溶液2 .00 mL，10 g/L 的 PVA-124 溶液0.50 mL，微乳液 0.50 mL，搖勻，然后用去離子水稀釋至25 mL，放置10 min，用熒光光譜儀分別掃描空白及離子締合物的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，確定體系的熒光最大激發(fā)波長(zhǎng)和最大發(fā)射波長(zhǎng)。

1.2.2 鹽酸用量的選擇 吸取1 μg/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.00，4.00 mL于25 mL比色管中，其它試劑固定不變，只改變鹽酸的用量(加入 1 mol/L 的 HCl溶液 0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mL)，分別測(cè)定空白熒光強(qiáng)度 F0及離子締合物溶液的熒光強(qiáng)度F，按式(1)計(jì)算熒光猝滅值ΔF，以ΔF對(duì)鹽酸用量繪制曲線，確定鹽酸的最佳用量。

1.2.3 碘化鉀用量的選擇 其它試劑不變，分別加入10%的碘化鉀溶液 0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL，測(cè)定空白熒光強(qiáng)度F0及離子締合物溶液的熒光強(qiáng)度F，按式(1)計(jì)算熒光猝滅值ΔF，以ΔF對(duì)碘化鉀用量繪制曲線，確定碘化鉀的最佳用量。

1.2.4 羅丹明B用量的選擇 其它試劑不變，分別加入1.0 ×10－5mol/L 的羅丹明 B 溶液 0.50，1.00，1.50，2 .00，2.50，3.00 mL，測(cè)定空白熒光強(qiáng)度 F0及離子締合物溶液的熒光強(qiáng)度F，按式(1)計(jì)算熒光猝滅值ΔF，以ΔF對(duì)羅丹明B用量繪制曲線，確定羅丹明B的最佳用量。

信息類試題往往是生物學(xué)考試中得分率較低、區(qū)分度較大的試題。學(xué)生往往讀不懂題干信息，不知道如何利用信息作答。之所以出現(xiàn)這兩個(gè)問(wèn)題，根本原因是學(xué)生缺乏獲取和解讀信息的能力、調(diào)動(dòng)和運(yùn)用知識(shí)的能力。

1.2.5 表面活性劑的選擇 其它試劑不變，分別加入不同種類、不同量的表面活性劑，測(cè)定空白和離子締合物的熒光強(qiáng)度，確定表面活性劑的種類及最佳用量。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 于25 mL比色管中分別加入1 μg/mL鐵標(biāo)準(zhǔn)工作溶液 0.00，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00，3.50，4.00，4.50 mL，10% 的碘化鉀溶液 1.00 mL，1 mol/L的HCl 2.00 mL，混勻后稀釋至10 mL，靜置10 min后，再加入1.0×10－5mol/L RB溶液2.00 mL，10 g/L的 PVA-124溶液0.50 mL，微乳液0.50 mL，搖勻，然后用去離子水稀釋至25 mL，放置10 min，用1 cm比色皿，以水作參比，于波長(zhǎng)λex/λem=352 nm/580 nm處測(cè)量試劑空白熒光強(qiáng)度F及離子締合物溶液的熒光強(qiáng)度F，按式(1)計(jì)算熒光猝滅值ΔF，以ΔF對(duì)鐵(Ⅲ)質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

由圖1可知，在表面活性劑PVA-124和微乳液存在下，體系的最大激發(fā)波長(zhǎng)為352 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm。KI—RB體系的激發(fā)和發(fā)射光譜(曲線1和3)熒光值明顯比Fe(Ⅲ)—KI—RB體系(曲線2和4)的熒光值高，說(shuō)明KI本身不與RB反應(yīng)形成離子締合物，但當(dāng)體系中有Fe3+存在時(shí)，F(xiàn)e3+可與KI反應(yīng)生成I2，I2再與過(guò)量的KI反應(yīng)生成I3一，I3一與RB形成離子締合物，使RB分子內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅，導(dǎo)致RB分子的熒光強(qiáng)度降低的結(jié)果。

圖1 熒光激發(fā)和發(fā)射光譜Figure 1 Excitation and emission spectra of fluorescence

2.2 酸度的影響

試驗(yàn)考察了不同濃度的HCl溶液對(duì)體系熒光猝滅值的影響見(jiàn)圖2，結(jié)果表明，當(dāng)加入1 mol/L HCl為2.00 mL時(shí)熒光猝滅值最大且穩(wěn)定。因此，本試驗(yàn)選擇1 mol/L HCl溶液為 2.00 mL。

2.3 碘化鉀用量試驗(yàn)

試驗(yàn)考察了0.1 mol/L KI溶液加入量對(duì)體系熒光猝滅情況的影響見(jiàn)圖3。體系的熒光猝滅情況先隨KI的加入量逐漸增加，當(dāng)加入 KI的量為1.00 mL時(shí)最大，但超過(guò)1.00 mL時(shí)又逐漸減小，這是因?yàn)镕e3+與過(guò)量KI反應(yīng)后生成I3－，I3－與RB形成離子締合物，使RB分子內(nèi)源性熒光發(fā)生猝滅，但碘化鉀濃度太大時(shí)，單位體積內(nèi)有效I3－相對(duì)較少，使RB分子內(nèi)源性熒光猝滅效應(yīng)相對(duì)減弱。因此，本試驗(yàn)選用KI加入量為1.00 mL。

圖2 鹽酸用量曲線Figure 2 Curve of hydrochloric acid used amount

圖3 碘化鉀用量曲線Figure 3 Curve of potassium iodide used amount

2.4 羅丹明B用量的影響

試驗(yàn)考察了不同量RB對(duì)體系熒光猝滅的影響見(jiàn)圖4。試驗(yàn)表明，熒光猝滅值隨RB溶液的增加而增大，當(dāng)RB溶液增加到2.00 mL時(shí)，熒光猝滅值最大且靈敏度最高;當(dāng)RB的用量超過(guò)2.00 mL后體系的熒光猝滅值逐漸減小，檢測(cè)的靈敏度降低，這可能是由于過(guò)量RB對(duì)于激發(fā)光的吸收具有隱蔽效應(yīng)所致。因此，本試驗(yàn)選擇RB最佳用量為2.00 mL。

圖4 羅丹明B用量曲線Figure 4 Curve of Rhodamine B used amount

2.5 表面活性劑的影響

試驗(yàn)考察了陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(SDBS)、陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTMBA)、阿拉伯樹(shù)膠、明膠、司班-40、司班-60、PVA-124、微乳液(VOP-10∶V正戊醇∶V正庚烷∶V水=3.2∶2.3∶0.5∶94)對(duì)體系熒光猝滅值的影響，試驗(yàn)表明，當(dāng)同時(shí)加入0.5 mL PVA-124(10 g/L)和0.5 mL微乳液時(shí)，體系熒光猝滅值最大且穩(wěn)定。

2.6 干擾離子

當(dāng)測(cè)定0.08 μg/mL鐵，相對(duì)誤差＜5%時(shí)，允許干擾離子的倍數(shù)為:1 000倍的Ca2+、Al3+;500倍的NH4+;400倍的F－;300倍的C2O42－;50倍的Cd2+、Mn2+;2倍的Cr(VI);0.5倍的 Cu2+;Na+、Mg2+、K+、Cl－、NO3－不干擾測(cè)定。

2.7 線性范圍及檢測(cè)下限

按(1.2.6)試驗(yàn)方法分別測(cè)定不同量的鐵加入后的熒光強(qiáng)度F和空白的熒光強(qiáng)度F0，以ΔF為縱坐標(biāo)，以鐵的質(zhì)量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線的回歸方程為ΔF=21.968C+4.176 9，鐵含量在0.02～4.50 μg/25 mL 范圍內(nèi)與 ΔF 呈良好的線性關(guān)系(見(jiàn)圖5)，相關(guān)系數(shù)為 γ=0.999 2，以空白的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以工作曲線的斜率得本方法的檢測(cè)下限為0.006 μg/25 mL。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 Standard curve

3 樣品分析及回收率測(cè)定

將花生置于105℃干燥箱中烘至恒重后研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取1.000 0 g粉末樣品于微波消解罐中，加入濃硝酸10 mL，30%過(guò)氧化氫2.0 mL，按照程序升溫進(jìn)行消解(微波程序升溫為:0～60℃，升溫2 min，停留1 min;60～120℃，升溫6 min，停留3 min;120～180℃，升溫6 min，停留10 min，微波功率為800 W，效率為100%)，消解完畢后取出罐體，冷卻至室溫，將消解液轉(zhuǎn)移至小燒杯中低溫加熱蒸至近干，取下加水溶解鹽類，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，稀釋至刻度搖勻備用。

移取5.00 mL樣品試液于25 mL比色管中，其余所加試劑按試驗(yàn)方法進(jìn)行。用1 cm比色皿，以水作參比，于波長(zhǎng)λex/λem=352 nm/580 nm處測(cè)量樣品溶液的熒光值F，計(jì)算熒光猝滅值ΔF，同時(shí)做加標(biāo)回收試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of samples(n=5)

4 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)Fe(Ⅲ)—KI—RB締合物熒光猝滅體系進(jìn)行了研究，優(yōu)化了體系的測(cè)量條件，并將該方法用于花生中微量鐵的測(cè)定，結(jié)果與原子吸收法［14］基本一致;方法具有較高的靈敏度，檢測(cè)下限低，可用于水樣、食品及中藥材中微量鐵的測(cè)定;由于體系所用的RB試劑具有較強(qiáng)的熒光特性，因此，要求測(cè)量者必須具有熟練的加液操作技能，否則會(huì)給樣品測(cè)定帶來(lái)誤差。

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