雷德柱 黃永健

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

納他霉素作為一種新型生物防霉劑，能夠?qū)Ｒ恍缘匾种平湍妇兔咕?，并有良好的理化穩(wěn)定性，目前已經(jīng)成為30多個(gè)國家廣泛使用的天然生物食品添加劑［1］。中國的GB 2760—2007也批準(zhǔn)納他霉素為食品添加劑，其商品名為霉克（NatamaxinTM）。目前，國際上已許可使用的生物防腐劑僅為乳酸鏈球菌素（nisin）、納他霉素（natamycin）及聚賴氨酸（s－poly－lysine）3種［2－4］。中國目前允 許使用的僅為乳酸鏈球菌素和納他霉素。研究［5］表明，大多數(shù)霉菌可被質(zhì)量濃度為1.0×10－3～6.0×10－3g/L的納他霉素抑制，極個(gè)別的霉菌被質(zhì)量濃度為1.0×10－2～2.5×10－2g/L的抑制。納他霉素除了用作食品防腐劑外，還可作為飼料添加劑及生物農(nóng)藥在畜牧業(yè)與農(nóng)業(yè)中應(yīng)用。2004年美國醫(yī)藥與食品管理局（FDA）批準(zhǔn)在青貯飼料中添加納他霉素以防治家禽真菌?。?］。

液體飼料在歐盟國家的生豬養(yǎng)殖中已被廣泛使用，荷蘭50%的豬都使用濕拌料，丹麥有30%以上的母豬使用發(fā)酵液體飼料，70%以上的母豬在泌乳期也使用發(fā)酵液體飼料［6－10］。近年中國也有一些液體飼料的應(yīng)用報(bào)道［11］。液體飼料使用中會(huì)遇到原料中不含有適于發(fā)酵的菌、飼喂系統(tǒng)含有大量的雜菌而導(dǎo)致飼料霉變等問題［12］。雙乙酸鈉（SDA）是一種優(yōu)良的飼料添加劑，既能防止飼料霉變保證飼料原料和飼料的質(zhì)量，又能夠提高動(dòng)物的生長性能促進(jìn)飼料營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，而且在一定程度上可降低動(dòng)物疾病的發(fā)生［13，14］。本研究擬選用兩種液體飼料作為研究對(duì)象，采用納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品作為飼料防霉劑，并嘗試將其與雙乙酸鈉復(fù)配，避開上述障礙進(jìn)行防霉試驗(yàn)，以期拓展納他霉素在飼料防霉中的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

虎紅培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基：廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品：生化試劑，錢江生化股份有限公司；

雙乙酸鈉：分析純，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；

奧利康：寵物液體飼料，包頭市康牧飼料有限公司；

Plankton－1：珊瑚成長糧，北京松濤恒業(yè)國際貿(mào)易有限公司；

納他霉素：本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

霉菌培養(yǎng)箱：MJX－160B－Z型，上海博迅儀器有限公司；

一次性細(xì)菌過濾器：JJJ50G型，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)條件

1.3.1 固體培養(yǎng)基稀釋法 抑菌譜和最低抑菌濃度試驗(yàn)采用。將不同濃度的防霉劑（已用細(xì)菌濾器過濾）加于45℃的虎紅培養(yǎng)基中，均勻混合，傾注平板。接種釀酒酵母、根霉、毛霉、黑曲霉、青霉、雜霉菌（根霉、毛霉、黑曲霉、青霉等濃度混合）于上述培養(yǎng)基中，于霉菌培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)3d，觀察待測(cè)菌生長情況。

1.3.2 飼料存放破壞性試驗(yàn) 分別取500mL樣品于5個(gè)體積相同的錐形瓶里，標(biāo)號(hào)為1，2，3，4，5。其中1號(hào)為空白對(duì)照組，2、3號(hào)為加入10mg/L納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)照試驗(yàn)組，4，5號(hào)為加入10mg/L納他霉素產(chǎn)品的對(duì)照試驗(yàn)組。將5個(gè)錐形瓶開口放置在30℃的恒溫水浴鍋里。每3d取樣一次，用涂布法在察氏培養(yǎng)基上測(cè)液體飼料中的霉菌總數(shù)，并且觀察液體飼料的表觀霉變情況。

1.3.3 飼料存放破壞性濃度梯度試驗(yàn) 分別取500mL樣品于4個(gè)體積相同的錐形瓶里，標(biāo)號(hào)為1，2，3，4。其中1號(hào)為空白對(duì)照組，2、3、4號(hào)為分別加入10，20，30mg/L納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品的試驗(yàn)組。將4個(gè)錐形瓶開口放置在常溫下。每3d取樣一次，用霉菌酵母測(cè)試片法測(cè)出每毫升液體飼料中的真菌總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌譜和最低抑菌濃度試驗(yàn)

表1、2分別為納他霉素最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果和雙乙酸鈉最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果。據(jù)報(bào)道［11］，絕大多數(shù)霉菌在0.5～6.0mg/L的納他霉素濃度下被抑制，極個(gè)別菌種在10～25mg/L的納他霉素濃度下被抑制；多數(shù)酵母在1～5mg/L的納他霉素濃度下被抑制。

由表1可知，納他霉素對(duì)常見幾種霉菌的最低抑菌濃度為3～6mg/L，與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的結(jié)果一致。而雙乙酸鈉的最低抑菌濃度是納他霉素的近1 000倍。因此，在飼料防霉性能方面納他霉素具有化學(xué)防霉劑不可比擬的優(yōu)越性。但單純使用納他霉素成本太高，而且濃度較高時(shí)納他霉素的溶解性不好，影響使用效果。

納他霉素與雙乙酸鈉復(fù)配試驗(yàn)結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)膹?fù)配組合（表3中組合5）能有效降低納他霉素和雙乙酸鈉的使用濃度，既可降低防霉成本，又可減少雙乙酸鈉對(duì)飼料適口性的影響。

表1 納他霉素最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The minimal concentration of natamycin for fungi inhibition

表1 納他霉素最低抑菌濃度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The minimal concentration of natamycin for fungi inhibition

＋表示有霉菌菌落；—表示無霉菌菌落（第一次出現(xiàn)時(shí)表示該質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度）。

納他霉素/（mg·L－1） 釀酒酵母 根霉 毛霉 黑曲霉 青霉 混合霉菌0＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋1＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋2＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋3－ ＋ － ＋ ＋ ＋4－ ＋ － ＋ － ＋5－ － － － － ＋6－ － － － － －7－ － － － － －

表2 雙乙酸鈉對(duì)雜霉菌最低抑菌濃度的試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The minimal concentration of sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition

表2 雙乙酸鈉對(duì)雜霉菌最低抑菌濃度的試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The minimal concentration of sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition

＋表示有霉菌菌落；—表示無霉菌菌落（第一次出現(xiàn)時(shí)表示該質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度）。

雙乙酸鈉/（g·L－1）0 1 2 3 4 5 6 7混合霉菌 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － －

表3 納他霉素與雙乙酸鈉復(fù)配抑菌的試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The combinations of natamycun and sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition

表3 納他霉素與雙乙酸鈉復(fù)配抑菌的試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The combinations of natamycun and sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition

＋表示有霉菌菌落；—表示無霉菌菌落（第一次出現(xiàn)時(shí)表示該質(zhì)量濃度為最低抑菌濃度）。

編號(hào) 納他霉素/（mg·L－1）雙乙酸鈉/（g·L－1） 防霉效果1 3 3 ＋2 3 4 ＋3 3 5 －4 3 6 －5 4 3 －6 4 4 ＋7 4 5 －8 4 6 －9 5 3 －10 5 4 －11 5 5 －12 5 6 －13 6 3 －14 6 4 －15 6 5 －16 6 6 －17 0 0 ＋

2.2 飼料破壞性存放試驗(yàn)

由圖1可知，使用納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品作為液體飼料（奧利康）防霉劑時(shí)，能有效防霉，每毫升飼料中的菌落數(shù)比對(duì)照減少3個(gè)數(shù)量級(jí)以上。使用較高濃度的納他霉素時(shí)，防霉效果比較低濃度的略好，但差異不顯著。這與納他霉素在溶液中的溶解度低，不利于擴(kuò)散有關(guān)。對(duì)照從第24天以后菌落數(shù)有所下降，可能是因?yàn)榫鷶?shù)過多，供試飼料中的養(yǎng)分被耗盡，部分菌體死亡。文獻(xiàn)［1］中報(bào)道納他霉素允許殘留量為10mg/L，兼顧防霉效果和防霉成本以及允許殘留量，以下試驗(yàn)中采用10mg/L納他霉素作為供試防霉劑。

圖1 不同納他霉素濃度下奧利康寵物飼料破壞性存放試驗(yàn)Figure 1 Destructive test at different concentration of natamycin on pet feed

圖2 珊瑚飼料破壞性存放試驗(yàn)Figure 2 Destructive test at 10mg/L of natamycin on coral feed

圖3 奧利康寵物飼料破壞性存放試驗(yàn)Figure 3 Destructive test at 10mg/L of natamycin on pet feed

由圖2、3可知，10mg/L納他霉素能夠有效控制兩種液體飼料存放過程中的霉菌生長，霉菌數(shù)量比對(duì)照低3個(gè)數(shù)量級(jí)。奧利康寵物飼料中的霉菌菌落數(shù)與珊瑚液體飼料略有差異，可能是由于兩者所含的營養(yǎng)成分不同，也可能是由于奧利康寵物飼料中含有有益微生物，部分抑制了雜菌的生長。表4、5的兩種飼料破壞性存放試驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果也證實(shí)了納他霉素良好的防霉效果，控制無菌膜時(shí)間分別達(dá)到18，24d。

表4 奧利康的寵物飼料破壞性存放試驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果（納他霉素濃度10mg/L）Table 4 Eye observation result of destructive test on pet feed at 10mg/L of natamycin

表4 奧利康的寵物飼料破壞性存放試驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果（納他霉素濃度10mg/L）Table 4 Eye observation result of destructive test on pet feed at 10mg/L of natamycin

＋表示有霉菌菌落；—表示無霉菌菌落。

時(shí)間/d 純品組 產(chǎn)品組 CK組3＋＋6－－＋＋＋－－＋＋＋12 － － ＋＋＋15 － － ＋＋＋18 － － ＋＋＋21 ＋ ＋ ＋＋＋24 ＋ ＋ ＋＋＋27 ＋ ＋ ＋＋＋9－－30 ＋ ＋ ＋＋＋

表5 珊瑚成長糧的破壞性存放試驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果（納他霉素濃度10mg/L）Table 5 Eye observation result of destructive test on coral feed at 10mg/L of natamycin

表5 珊瑚成長糧的破壞性存放試驗(yàn)肉眼觀察結(jié)果（納他霉素濃度10mg/L）Table 5 Eye observation result of destructive test on coral feed at 10mg/L of natamycin

＋表示有霉菌菌落；—表示無霉菌菌落。

時(shí)間/d 純品組 產(chǎn)品組 CK組3－－－6－－－9－－＋12－－＋15 － － ＋＋18 － － ＋＋21 － － ＋＋＋24 － － ＋＋＋27 ＋ ＋ ＋＋＋30 ＋ ＋ ＋＋＋

3 結(jié)論

納他霉素單獨(dú)使用時(shí)最低抑菌濃度范圍為3～6mg/L，與化學(xué)防霉劑雙乙酸鈉復(fù)配使用時(shí)，可降低防霉劑的最低抑菌濃度，從食品安全的角度應(yīng)選擇復(fù)配比例為4mg/L∶3g/L，既保證食品飼料的安全性，又可增加防霉劑的抑制效果。從破壞性試驗(yàn)中可看出，不同濃度的納他霉素對(duì)液體飼料都有顯著的防霉作用，真菌總數(shù)都比空白對(duì)照組大大減少。從防霉效果和經(jīng)濟(jì)角度綜合考慮，選擇納他霉素10mg/L。在破壞性表觀試驗(yàn)中，添加了納他霉素的液體飼料長期暴露在空氣中表觀上沒有明顯的變化，而空白對(duì)照組的液體飼料前3d在液面會(huì)形成一層菌膜。綜上所述，納他霉素在液體飼料的應(yīng)用中，有效解決了納他霉素在固體飼料中難以擴(kuò)散的問題，納他霉素可溶解在液體飼料中并對(duì)其起到了很好的抑菌作用。

1 岳昊博，岳喜慶，李靖，等.納他霉素（Natamycin）的特性、應(yīng)用及生產(chǎn)和研究狀況［J］.食品科技，2007，32（3）：162～166.

2 李東.多烯大環(huán)抗真菌劑納他霉素的研究［D］.天津：天津科技大學(xué)，2005.

3 金豐秋，金其榮.新型生物防腐劑——聚賴氨酸［J］.中國食品添加劑，2003（5）：87.

4 李勃，馮光利，王長曄.納他霉素產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及前景［J］.保鮮與加工，2011，11（2）：49～53.

5 李東，杜連祥，路福平，等.納他霉素的抑菌譜及最小抑菌濃度［J］.食品工業(yè)科技，2004，25（7）：143～144.

6 Scholten R H J，van der Peet－Schwering C M C，Verstegen M W A，et al.Fermented co－products and fermented compound diets for pigs：a review［J］.Animal Feed Science and Technology，1999，82（1）：1～19.

7 Brooks P H，Beal J D，Niven S.Liquid feeding of pigs：potential for reducing environmental impact and for improving productivity and food safety［J］.Recent Advance in Animal Nutrition in Australia，2001（13）：49～63.

8 Garnsworthy P C，Wiseman J.Recent advances in animal nutrition［M］. Nottingham：Nottingham University Press，1998：107～126.

9 Canibe N，Jensen B B.Fermented and non fermented liquid feed to growing pigs：effect on aspects of gastrointestinal ecology and growth performance［J］.Journal of Animal Science，2003，81（8）：2 019～2 031.

10 Adams M R，Nicolaides L.Review of the sensitivity of different food borne pathogens to fermentation［J］.Food Control，1997，8（5）：227～239.

11 李朕杰，余紅心，盧躍紅，等.液體飼料在養(yǎng)牛生產(chǎn)中的配制及應(yīng)用［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2005，27（3）：122～126.

12 李軍，張日俊.發(fā)酵液體飼料的研究進(jìn)展［J］。國外畜牧科技，2011，28（6）：21～23.

13 楊曉麗，韓克勤.雙乙酸鈉對(duì)霉菌的抑制作用的研究［J］天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，2（2）：26～28.

14 聶昌林，宋春陽.雙乙酸鈉在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.飼料廣角，2013（2）：45～46.