李 霞，陳新諾，王 蕾，姚 梅，劉芳田，岳 華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

近年來，腸道微生物菌群對動(dòng)物機(jī)體的健康和疾病的影響越來越受到人們的關(guān)注[1]。從DNA分子水平診斷山羊細(xì)菌感染和帶菌情況是目前臨床診斷的發(fā)展趨勢。因此，對臨床標(biāo)本中細(xì)菌DNA提取方法的優(yōu)化顯得尤為重要；同時(shí)，提取細(xì)菌DNA對于宿主本身的基因測序及疾病診斷也很重要。從糞便中提取總DNA不僅方便，且提取的DNA種類繁多，如果提取的總DNA片段完整性好，濃度、純度高，那么用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)則方便快捷。目前，從糞便標(biāo)本中提取DNA的方法眾多，但由于提取機(jī)理和步驟的差別，同時(shí)又由于宿主不同，所獲得的DNA濃度、純度和完整性就各不相同，導(dǎo)致在后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如PCR擴(kuò)增、DNA測序和限制性核酸內(nèi)切酶的分析等）中的應(yīng)用效果不同[2]。

關(guān)于山羊糞便中細(xì)菌DNA提取方法的研究，之前尚未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)在提取山羊糞便中細(xì)菌DNA的基礎(chǔ)上，提取山羊糞便總DNA，以探索出最適于提取山羊糞便總DNA的方法，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供基礎(chǔ)材料。現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 主要試劑 磷酸鹽緩沖液（PBS），TE緩沖液，十二烷基硫酸鈉（SDS），酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），氯仿∶異戊醇（24∶1），無水乙醇，5mol/L NaCl，十六烷基-三甲基-溴化銨（CTAB），溶菌酶，蛋白酶 K，DNA Marker，天根試劑盒，OMEGA試劑盒。

1.2 主要儀器 恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、漩渦振蕩儀、加熱爐、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、核酸蛋白檢測儀。

1.3 糞便樣本的收集與預(yù)處理 直接采集山羊新鮮糞便于15mL滅菌EP管中，-20℃保存，待提取總DNA用。預(yù)處理：稱取3g糞便樣本，置于15mL EP管中，搗碎混勻，加 18 mL PBS緩沖液（pH 7.4），放入搖床過夜。取出過夜處理的糞便樣本，渦旋混勻3～5min，3000r/min 離心 3min，取上清。重復(fù)以上步驟3次。取上清分裝成6份，每份1.5mL，裝入1.5mL EP管，12000r/min離心10min，棄上清。

1.4 四種方法提取細(xì)菌DNA

1.4.1 酚-氯仿抽提法。將所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶，混勻后37℃水浴1h，加65μL蛋白酶K和65μL 10%SDS，混勻后37℃水浴2h。然后再用等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提 1 次，4℃、12000r/min離心10min后取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），4℃、12000r/min離心 10min后取上清，然后用2倍無水乙醇沉淀DNA，4℃、12000r/min離心5min取上清，最后用70%乙醇洗滌沉淀，干燥后將DNA沉淀溶于50 μL TE緩沖液中，-20℃保存。

1.4.2 CTAB法。將所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶，混勻后37℃水浴1 h，加入30 μL蛋白酶K和30μL 10%SDS，37℃水浴2h，然后再加入100μL 5mol/L NaCl和 80μL CTAB/NaCl，65℃水浴 10min。水浴結(jié)束后再用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提，最后將DNA沉淀溶于50μL TE，-20℃保存。

1.4.3 天根試劑盒法。按照試劑盒要求操作，最后將所得DNA溶液于-20℃保存。

1.4.4 OMEGA試劑盒法。按照試劑盒要求操作，最后將所得DNA溶液于-20℃保存。

將以上4種方法提取的DNA均取4 μL上樣在0.8%瓊脂糖凝膠中電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，判斷DNA完整性。

2 結(jié)果

2.1 DNA電泳檢測結(jié)果 從圖1可見，酚-氯仿抽提法和CTAB法提取的DNA電泳條帶較明亮，但有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，說明酚-氯仿法和CTAB法提取的DNA濃度較高，但都降解成了大量的小片段。天根試劑盒法和OMEGA試劑盒法抽提的糞便DNA全是均勻的抹帶，說明這兩個(gè)試劑盒抽提的DNA完整性好，且天根試劑盒法的抹帶比OMEGA試劑盒法的亮，說明天根試劑盒法提取的DNA濃度更高。

圖1 四種方法提取的糞便DNA電泳圖譜

2.2 DNA含量和純度的檢測 由表1可以看出，酚-氯仿抽提法和CTAB法提取出的糞便總DNA含量較高，而天根試劑盒法和OMEGA試劑盒法提取的糞便總DNA含量偏低。OD260/OD280反映了DNA的純度，正常情況下OD260/OD280值約為1.7～2.0，若OD260/OD280值小于1.7或大于2.0，說明可能有蛋白質(zhì)污染或RNA污染[3]。酚-氯仿抽提法和OMEGA試劑盒法提取DNA的OD260/OD280值均大于2.0，說明存在RNA污染。CTAB法和天根試劑盒法提取DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0內(nèi)，說明天根試劑盒法和CTAB法提取的DNA純度較高。

表1 糞便樣品中的DNA含量和OD260/OD280值（n=3）

3 分析

關(guān)于糞便中提取細(xì)菌總DNA的方法，目前的報(bào)道雖然較多，但由于其提取機(jī)理和步驟的差異，所獲得的DNA含量和純度也各不相同，導(dǎo)致在后續(xù)實(shí)驗(yàn)（如PCR擴(kuò)增、DNA測序等）過程中的結(jié)果差異很大[4]。本實(shí)驗(yàn)比較了四種從糞便標(biāo)本中提取總DNA的方法，得到了可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的DNA模板。

基因組DNA提取的理想方法，首先要考慮到DNA的純度和濃度，這是分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)[5]，其次要考慮到DNA的得率，即提取率，要盡可能減少DNA的降解[6]。本實(shí)驗(yàn)提取的是山羊糞便總DNA，所以提取DNA的完整性很重要。通過對四種提取方法的比較，我們發(fā)現(xiàn)天根試劑盒法提取的糞便總DNA雖然濃度較低，但純度高，完整性好，能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供完整的DNA片段。本次實(shí)驗(yàn)預(yù)處理過程中將加PBS的糞便樣本放入搖床過夜，目的是使糞便充分溶解以保障抽提到高質(zhì)量的DNA。

4 結(jié)論

四種方法均能提取出DNA，傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法經(jīng)濟(jì)可靠，但提取的DNA完整性不好，且純度低。CTAB法提取的DNA濃度和純度都較高，但大量降解。天根試劑盒法提取的DNA雖然濃度低，但操作方便簡單，時(shí)間短，純度高，完整性好，質(zhì)量穩(wěn)定。OMEGA試劑盒法提取的DNA完整性好，但純度和濃度都較低。綜合考慮，推薦使用天根試劑盒法作為提取山羊糞便總DNA的方法。

[1]Nicholson J K， Holmes E， Wilson I D.Gut microorganisms，mammalian metabolism and personalized health care[J].Nature Reviews Microbiology，2005，3（5）:431-438.

[2]陳蓓，黃瑞.糞便標(biāo)本中細(xì)菌DNA提取方法的比較[J].中國血液流變學(xué)雜志，2007，17（2）:210-212.

[3]吳銀寶，史金才，莫測輝，等.豬糞和土壤樣品中微生物DNA提取方法的比較[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2006，22（增刊 2）:10-13.

[4]陶新，徐子偉，鄧波，等.少量動(dòng)物糞便細(xì)菌總DNA提取方法的研究[J].中國畜牧雜志，2009，45（23）:68-70.

[5]張寧，王鳳山.DNA提取方法進(jìn)展[J].中國海洋藥物，2004，25（2）:40-46.

[6]Chen H，Rangasamy M，Tan SY，et al.Evaluation of five methods for total DNA extraction from western corn rootworm beetles[J].PLoS One，2010，5（8）:1-6.